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急性髓系白血病（AML）分子分型在巴西通过简化NGS工作流程实现，并与欧洲实验室验证一致性。15例患者样本经iSeq100测序分析 FLT3、NPM1、IDH1等8个基因，结果显示 Brazilian实验室与荷兰参考实验室变异频率一致性达0.72，与PCR方法符合率77%。研究证实国际合作、设备捐赠和标准化培训能有效解决资源限制地区的NGS实施难题。
Rita de Cássia Cavaglieri|Luciana Nardinelli|Melissa Rijken|Ana Silvia Gouveia-Lima|Peter J.M. Valk|Fabíola Traina|Eduardo M. Rego
圣保罗大学医学院内科血液学系医学研究实验室-31（LIM-31），巴西圣保罗
摘要
下一代测序（NGS）通过同时检测多种具有临床意义的突变，彻底改变了急性髓系白血病（AML）的诊断和预后评估。然而，由于经济和基础设施的限制，许多拉丁美洲国家仍难以获得这项技术。本研究报道了在急性白血病国际联盟（ICAL）中实施和验证了一种用于AML分子分析的NGS工作流程，并强调了其在巴西各参考实验室中的可行性和重复性。iSeq100测序仪（Illumina公司提供）被捐赠给了ICAL的各个中心，实验室人员通过伊拉斯姆斯医学中心（鹿特丹）的美国血液学会访问者培训计划接受了培训。分析了参与ICAL-2015研究的15名AML患者的基因组DNA，使用了一个针对FLT3、NPM1、IDH1、IDH2、ASXL1、CEBPA、TP53和RUNX1的定制扩增子检测面板。结果在两个巴西实验室、一个欧洲参考实验室以及传统的单基因检测方法之间进行了比较。NGS在变异等位基因频率方面表现出良好的实验室间一致性（Pearson r = 0.72）。NGS与基于PCR的方法之间的共识率达到77%，不一致的案例主要涉及FLT3-ITD的检测和ASXL1突变的评估。突变频率与欧洲和北美队列报告的结果一致。本研究表明，通过国际合作、培训以及标准化协议，即使在资源有限的条件下，也可以成功建立并控制NGS工作流程的质量。
引言
急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中未成熟髓系前体的克隆性增殖，导致造血功能紊乱和严重的细胞减少。
该疾病主要影响成年人——尤其是60岁以上的人群——在拉丁美洲，高死亡率与诊断能力和专科护理资源的分配不均问题密切相关。
最新的《世界卫生组织（WHO）血液淋巴系统肿瘤分类》和《欧洲白血病网（ELN）建议》强调了遗传异常在AML诊断、预后分层、最小残留病监测和治疗选择中的核心作用。
NGS相对于传统方法的主要优势在于其能够同时全面分析数千个基因突变，从而更详细地描述白血病基因组。这种高覆盖率提高了诊断准确性，使得传统方法可能遗漏的罕见遗传变异或亚克隆变异得以发现。此外，NGS的快速出结果时间也是一个关键特点，因为它显著加快了检测速度，有助于尽早开始治疗，从而可能改善预后，尤其是在像AML这样需要及时治疗的快速进展性疾病中。
在这种背景下，NGS已成为定义AML分子特征的变革性工具，能够全面检测影响风险评估和治疗决策的体细胞突变。尽管现代NGS平台在区域范围内已经普及，但在拉丁美洲各地的获取情况仍不均衡，限制了分子诊断在临床实践中的广泛应用。
为解决这些差异并促进临床研究合作，2004年在美国血液学会国际成员委员会的主持下成立了急性早幼粒细胞白血病国际联盟（IC-APL）。随后该联盟扩大规模并更名为急性白血病国际联盟（ICAL），以涵盖更多AML亚型。ICAL的核心原则是组织合作性的国家级网络，而不是孤立的机构努力，从而根据当地基础设施和资源制定统一的诊断、治疗和支持性护理方案。
在拉丁美洲，实施NGS进行AML诊断面临超出财务限制的挑战。作为地理面积广阔且地区差异较大的国家，巴西在公共卫生系统中缺乏专业人才，尤其是受过生物信息学培训的人员。此外，维持外部质量控制和与国际公认的参考实验室的交流对于确保分子结果的可靠性至关重要。在本研究中，我们描述了在ICAL-2015研究（NCT03023384）中纳入简化型、以临床为导向的NGS基因检测面板，以优化成年AML患者的分子特征和风险分层的实施过程及其益处。
研究参与资格标准
符合条件的患者年龄在18至65岁之间，根据WHO标准被诊断为急性髓系白血病（AML），未接受过任何治疗，无t(15;17)或PML::RARA重排的证据，提供书面知情同意书，并能遵守研究方案。
在ICAL中心建立NGS技术
为了在参与ICAL项目的中心建立NGS技术，我们收到了两台iSeq100测序仪（Illumina公司提供），相应的试剂也由Torsten Haferlach白血病诊断基金会慷慨捐赠。美国血液学会（ASH）通过其访问者培训计划（VTP）支持了两名实验室工作人员的初始培训，该培训在伊拉斯姆斯医学中心癌症研究所Peter Valk博士的实验室进行。
下一代测序（NGS）
使用Gentra Puregene试剂盒（Qiagen公司）从AML诊断时采集的300 μL骨髓或外周血样本中提取基因组DNA，并进行了少量修改。通过分光光度法评估DNA纯度，仅纳入A260/280比值在1.8至2.0之间、A260/230比值在2.0至2.2之间的样本。后续分析中，每个反应使用了10 ng的高质量DNA。DNA定量通过Qubit荧光分析仪进行。
单基因突变分析
FLT3突变的检测采用了PCR-毛细管电泳（PCR-CE）片段分析的黄金标准方法。PCR扩增使用荧光标记的引物，针对外显子14-15（用于检测内部串联重复突变ITD）和外显子20（用于分析涉及D835/I836的酪氨酸激酶结构域（TKD）突变，具体方法参考Murphy等人（2003年）的研究。
生物信息学分析
来自iSeq 100测序仪的原始测序数据文件（BCL）通过bcl2fastq2（Illumina公司）工具进行解复用并转换为FASTQ格式。使用fastp工具评估序列质量和预处理。序列比对使用BWA-MEM和默认参数与人类参考基因组hg19/GRCh37对齐。比对后的后续处理，包括排序和索引，由Picard工具完成。
人口统计数据
训练队列的基本人口统计和血液学特征见表1。患者的中位年龄为50岁（范围19–64岁），其中大多数为女性（15人中的10人）。诊断时，中位血红蛋白浓度为7.45 g/dL（范围6.5–9.2），中位白细胞计数为32.14 × 103/mm3（范围0.64–162.28），中位血小板计数为27 × 103/mm3（范围13–126）。骨髓评估显示中位原始细胞比例为66%（范围……）
实验室和方法之间的结果一致性
在我们研究的15名AML患者中，NGS结果在两个巴西实验室和荷兰参考实验室之间完全一致。NGS与基于PCR的方法之间的共识率为77%。NGS检测到5名患者存在NPM1突变（NM_002520），这些突变被两个巴西实验室和荷兰参考实验室独立检测到。所有通过NGS检测到的NPM1变异都通过基于PCR的单基因分析得到了确认。
ICAL中NGS应用的未来方向
ICAL的研究在巴西、智利、秘鲁和乌拉圭进行。每个参与国家都建立了国家参考实验室，并实施了统一的策略来引入NGS技术并培训当地人员。这一倡议得到了ASH基金会、Torsten Haferlach基金会（慷慨捐赠设备和耗材，包括试剂盒、流式细胞仪和索引）以及Valk实验室（提供关键试剂）的支持。CRediT作者贡献声明
Rita de Cássia Cavaglieri：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。
Luciana Nardinelli：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。
数据管理，数据分析，方法学研究，验证。
Ana Silvia Gouveia-Lima：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。
Peter J.M. Valk：概念设计，数据管理，数据分析，方法学研究，资源协调，监督，验证，撰写——审稿与编辑。
Fabíola Traina：撰写——审稿与编辑。
