首次接触阳离子树状大分子会同时决定铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对纳米材料和抗生素的抗性或敏感性发展情况

碳硅烷树状大分子（BDTRP001）反复暴露导致假单胞菌PAO1膜通透性改变，产生耐药性并影响抗生素敏感性。低剂量诱导对树状大分子及多粘菌素B耐药，高剂量则不诱导耐药反而增加氯霉素敏感性。长期使用可能引发耐药性风险，但高剂量初始应用可缓解此问题。

　　

米哈尔·德特卡（Micha? Detka）| 卡罗琳娜·拉赫（Karolina Lach）| 奥斯卡·巴里奥斯-古米埃尔（óscar Barrios-Gumiel）| 多罗塔·库茨-切普卢赫（Dorota Kuc-Ciepluch）| 米哈尔·戈尔兹基维奇（Micha? Gorzkiewicz）| 里沙德·托马修克（Ryszard Tomasiuk）| 马格达莱娜·拉萨克（Magdalena Lasak）| 卡塔日娜·杜尔利克-波皮恩斯卡（Katarzyna Durlik-Popińska）| 阿卡迪乌什·格沃瓦茨基（Arkadiusz G?owacki）| 哈维尔·桑切斯-尼维斯（Javier Sanchez-Nieves）| 赫苏斯·卡诺（Jesús Cano）| 卡罗尔·切普卢赫（Karol Ciepluch）

波兰基尔采的扬·科查诺夫斯基大学（Jan Kochanowski University in Kielce）医学生物学系

摘要

阳离子树状大分子被认为是最有前景的抗菌剂之一，其作用机制在于破坏革兰氏阴性细菌的外膜。尽管它们被视为抗生素的替代品，但长期使用后可能会失去效力。虽然细菌对金属纳米颗粒的耐药性已被广泛研究，但树状大分子的耐药性发展尚未得到充分探讨。本文报道，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1在反复接触后可能对碳硅烷树状大分子产生耐药性。这种耐药性源于细菌膜表面的变化，导致膜通透性的改变。最初，低剂量的树状大分子会引发对树状大分子和多粘菌素B（polymyxin-B）的耐药性；而高剂量则不会引发耐药性，反而会增加对氯霉素（chloramphenicol）的敏感性。因此，长期使用树状大分子可能会增加对树状大分子和抗生素的耐药风险，不过立即使用高剂量可以消除这一现象。

引言

自世界卫生组织（WHO）于2015年发布《通过ESKAPE细菌对抗抗菌素耐药性的全球行动计划》以来，关于抗生素替代品的科学报告数量几乎呈指数级增长[1]。不幸的是，抗生素耐药性仍然是一个全球性的健康挑战。它通常与细菌及其基因在人类、动物和环境之间的传播增加有关[2][3][4]。然而，目前使用的抗生素替代品的潜在应用存在许多限制。随着时间的推移，抗生素和其他抗菌剂的使用促使细菌发展出复杂的防御机制，即耐药性。面对抗菌素耐药性（AMR）这一全球性威胁，科学界面临着快速有效制定替代方案的压力[2][3][4][5][6][7]。 目前，具有替代抗生素潜力的抗菌剂可以根据其抗菌机制分为不同类别，包括天然抗菌肽[8][9][10]和蛋白质[11][12][13][14][15][16]，以及合成材料，如纳米材料[17][18][19][20]。基于纳米材料的药物对抗耐药性病原体备受期待，因为它们的独特尺寸、性质和易于改性使其能够有效攻击浮游细菌和形成生物膜的细菌。一些纳米材料已广泛应用于医学领域，例如作为消毒剂。例如，银纳米颗粒（silver nanoparticles）的作用机制可能包括破坏细菌膜、与细胞内成分（如DNA）结合、生成活性氧物种或通过膜融合传递治疗剂[21][22][23][24]。然而，最近的研究表明，银纳米颗粒的广泛使用导致其在环境中的积累，迫使细菌发展出新的防御机制，如形成生物膜、改变运动能力、形态和膜组成、过量产生外排系统成分、干扰细胞分裂或激活特定操纵子[25][26][27][28][29][30][31][32][33][34][35]。此外，对纳米材料的耐药性与对抗生素的耐药性之间存在关联，这使得对抗菌剂的普遍耐药性成为一个更加严峻的挑战[33][36][37][38][39]。 由于某些纳米化合物（如阳离子聚合物）易于合成和改性，可以将其作用定向到在耐药性发展过程中不受影响的靶点。与线性聚合物不同，高度分支的树状聚合物是结构紧凑且无缠结的物质，其物理化学性质易于三维调控，理论上有助于合成更有效的抗菌剂。 通过合成方法可以调节和控制阳离子聚合物（包括树状大分子）的尺寸、分支程度和功能。这样，这些结构能够提供高度多价的表面，最大化其与环境的相互作用[40]。因此，正是阳离子表面的电荷决定了树状大分子的抗菌性能。 阳离子树状大分子的破坏作用机制基于与带负电荷脂质的静电相互作用[41][42]：它们与膜结合，置换二价阳离子（如Mg2+和Ca2+），并破坏脂质双层，从而在膜上形成孔洞。细菌死亡是由于膜结构破坏和功能丧失所致。这一机制严格依赖于树状大分子的浓度、电荷（阳离子残基的数量）以及所使用的树状大分子类型。由此可见，抗菌树状大分子能够物理性地破坏细菌的外膜——特别是那些表面含有季铵基团的树状大分子，它们能轻易与带负电荷的脂质相互作用。尽管细菌可以为了防御目的改变外膜的脂质组成，但通过快速调整颗粒大小、表面电荷或与其他活性功能结合，可以获得更强的抗菌效果[36][37][38][39]。 尽管似乎有办法克服纳米化合物的耐药性问题（例如通过合成具有独特性质的新的系统），但长期使用同一化合物仍可能产生类似效应（如纳米银的情况）。金属纳米颗粒会诱导活性氧物种的产生，而细菌早已对其产生了耐药性，例如通过silS或cusS/OmpC等特定操纵子的存在。SilS和CusS/OmpC的突变是产生高耐银离子水平的不同途径。迄今为止，尚未发现类似的对抗阳离子树状大分子耐药性的机制。然而，已证明对纳米材料的耐药性需要长期暴露。因此，即使是对耐药性发展潜力最低的材料（如树状大分子），也不能假设长期使用会在细菌中产生相同的效果。需要注意的是，耐药性可能具有遗传性，因此长期使用这些物质可能无效。因此，本研究探讨了铜绿假单胞菌长期接触带有正电荷功能基团的阳离子（咪唑基）碳硅烷树状大分子是否会导致其对这些大分子的耐药性，以及这种耐药性是否与对抗生素的耐药性或敏感性有关。

树状大分子的合成

咪唑基碳硅烷树状大分子BDTRP001（图1）是根据先前描述的方法制备的[44]。

长期暴露下碳硅烷树状大分子BDTRP001的最低抑菌浓度测定

使用野生型铜绿假单胞菌 PAO1测试了树状大分子BDTRP001的抗菌活性。树状大分子BDTRP001的浓度分别为0、16、32、64、128、256和512 μg/mL。该活性通过在600 nm波长下使用TECAN SPARK Magellan V2.2 STD光谱仪（Tecan Group Ltd., Switzerland）对指数生长的PAO1培养物进行24小时孵育后进行测量。

树状大分子BDTRP001最低抑菌浓度的增加

阳离子树状大分子是抗生素最有前景的替代品之一。此前我们已经研究了某些树状大分子（如碳硅烷树状大分子BDTRP001）作为溶菌素载体，以促进水解酶与革兰氏阴性细菌膜之间的相互作用，并研究了酶和碳硅烷树状大分子的协同作用[44]。因此，研究树状大分子可能引发的耐药性是一个重要的课题。

结论

用阳离子碳硅烷树状大分子（BDTRP001）处理的细菌，在不同浓度下对细菌的耐药性和敏感性有不同的影响。较低的初始剂量会导致细菌在长期使用过程中对树状大分子产生耐药性，并增加对多粘菌素B的耐药性。这种适应性变化可能是由于细菌膜的变化所致。

资助声明

本研究得到了Radioprotect P2022BMD-7406（马德里自治区（Comunidad de Madrid, CAM））和PIUAH24/CCS-034（UAH）的资助。此外，该研究还得到了CIBER（生物工程、生物材料和纳米医学CIBER-BBN，CB06/01/1021）、卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）和MICIU欧洲区域发展基金的支持。同时，拉多姆卡西米尔·普拉斯基大学（Casimir Pulaski University of Radom）和基尔采扬·科查诺夫斯基大学（Jan Kochanowski University in Kielce）也提供了内部资助。 本研究未使用任何人工智能工具。

数据可用性声明

数据将在合理请求下由通讯作者提供。

CRediT作者贡献声明

卡塔日娜·杜尔利克-波皮恩斯卡（Katarzyna Durlik-Popińska）：研究、方法学。 马格达莱娜·拉萨克（Magdalena Lasak）：研究、方法学。 哈维尔·桑切斯-尼维斯（Javier Sanchez-Nieves）：写作、审稿与编辑。 卡罗尔·切普卢赫（Karol Ciepluch）：资金筹集、项目管理、监督、初稿撰写。 阿卡迪乌什·格沃瓦茨基（Arkadiusz G?owacki）：研究、方法学。 多罗塔·库茨-切普卢赫（Dorota Kuc-Ciepluch）：写作、初稿撰写。 奥斯卡·巴里奥斯-古米埃尔（óscar Barrios-Gumiel）：研究、方法学。 里沙德·托马修克（Ryszard Tomasiuk）：资金筹集、写作、审稿与编辑。 米哈尔·戈尔兹基维奇（Micha? Gorzkiewicz）：写作、审稿。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。