从图片到洞见：一种用于FFPE小鼠骨髓的优化多重染色组，实现了造血微环境的空间解析

为解决小鼠骨髓空间结构解析的技术瓶颈，研究人员优化了FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本制备流程，开发了一个高效的mIHC（多重免疫组化）染色组。该组可同时检测c-Kit、Sca1、CD41、endomucin等多个标志物，在单一切片中保留空间信息。应用该组于Jak2V617F小鼠骨髓，揭示了巨核细胞微环境的改变，为造血相关疾病的病理空间特征检测提供了实用工具。

　　

造血系统就像人体内一座精密运行、日夜不休的“血细胞工厂”，其核心是造血干细胞(HSC)。这些干细胞“种子”居住在骨髓这个特殊的“微环境”（也称生态位）中。它们的命运——是安静休眠、自我更新，还是分化为各类成熟血细胞——受到周围“邻居”细胞（如血管、巨核细胞、成骨细胞等）及其构成的复杂三维空间的严密调控。理解这个“工厂”的“车间布局”和“同事关系”，对于揭示正常造血和恶性血液疾病（如白血病、骨髓增殖性肿瘤）的发病机制至关重要。

然而，看清这幅“布局图”并非易事。传统金标准流式细胞术虽然能高速分析细胞组成，但需要将组织打散成单个细胞，宝贵的空间位置信息就此丢失。而能保留组织结构的免疫荧光技术，又受限于每次只能看少数几个“标签”（标记物）。近年来兴起的多重成像技术，如CODEX和多重免疫组化(mIHC)，让我们有望在同一张组织切片上同时看到几十个甚至更多“标签”，从而获得骨髓“车间”更全面的“全景照片”。尽管小鼠是研究造血不可或缺的模型，但针对小鼠骨髓，特别是经过福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)这种能长期保存、形态更佳的处理方式的小鼠骨髓，已验证的多重染色方案仍然非常有限。FFPE骨髓样本存在高自体荧光、抗原修复易损伤组织等特有挑战，使得高质量多重成像困难重重。

针对这一技术空白，来自德国弗莱堡大学的研究团队在《Experimental Hematology》上发表了一项研究。他们成功优化了小鼠FFPE骨髓样本的制备流程，并建立了一个高效的mIHC染色组，使其能够在天然空间结构中可视化造血干细胞及其关键生态位细胞。更重要的是，他们将该方法应用于著名的骨髓增殖性肿瘤模型——Jak2^V617F小鼠的骨髓切片，成功捕捉到了疾病状态下巨核细胞生态位的特异性空间改变，证明了该技术在揭示造血疾病相关空间特征方面的强大应用潜力。

为了完成这项研究，作者们运用了几个关键的技术方法。他们首先系统优化了从小鼠股骨分离、固定、脱钙、石蜡包埋到切片的整个组织处理流程。针对FFPE样本的高自体荧光背景，他们采用了高效的光漂白技术来淬灭非特异性信号。核心的染色技术是基于酪酰胺信号放大(TSA) 原理的多重免疫组化(mIHC)，使用了Akoya Biosciences的Opal多色检测系统，能够在一张3微米厚的切片上循环检测多达7个标志物。图像获取后，利用光谱拆分技术分离重叠的荧光信号，并使用QuPath软件进行细胞检测、组织分割和空间距离分析，量化目标细胞与各生态位结构（如血窦、小动脉、巨核细胞、骨内膜）之间的空间关系。研究中使用了野生型小鼠、全身表达GFP的UBC-GFP转基因小鼠（用于移植模型）以及携带Jak2^V617F驱动突变的小鼠模型（模拟人骨髓增殖性肿瘤）的股骨样本。

优化的小鼠FFPE骨髓免疫荧光和多重免疫组化染色组织制备方案

研究人员首先建立并优化了一套适用于FFPE骨髓切片的标准流程。他们发现，3微米的切片厚度在细胞分辨率和组织完整性之间取得了最佳平衡。小鼠骨髓存在强烈自体荧光，尤其在绿色光谱范围，会干扰如Alexa Fluor 488标记的c-Kit等信号的检测。通过应用高强度LED光的光漂白方案，他们有效降低了这种背景噪音。在抗原修复条件的优化中，他们比较了不同固定时间和修复时间，最终确定2小时固定结合pH 9缓冲液中5分钟压力锅修复，既能获得强信号强度，又能最好地保持组织形态（特别是致密骨层的附着）。针对其抗体组合（c-Kit, Sca1, GFP, CD41, endomucin）的测试表明，pH 9的修复条件能普遍产生更强的信号。

多重免疫组化染色检测FFPE切片中小鼠骨髓生态位的关键组分

在优化单标条件的基础上，研究人员将这些抗体整合进一个基于Opal技术的mIHC染色组。该组合包括：识别造血干/祖细胞(HSPC)的c-Kit和Sca1，识别血窦内皮细胞的endomucin，识别巨核细胞的CD41，以及用于检测GFP标记细胞的抗GFP抗体和核染DAPI。他们将此组应用于接受了UBC-GFP供体细胞移植的小鼠骨髓切片。通过光谱拆分和QuPath软件分析，他们能够量化DAPI⁺、GFP⁺、c-Kit⁺和c-Kit⁺/Sca1⁺细胞的密度和大小。结果显示，c-Kit⁺细胞占7.7%，c-Kit⁺/Sca1⁺细胞（代表HSC）占0.9%，与既往流式结果吻合。同时，他们通过机器学习方法识别了CD41⁺巨核细胞和endomucin⁺血窦，并手动标注了Sca1⁺小动脉和骨内膜表面。空间分析揭示，超过90%的c-Kit⁺/Sca1⁺细胞位于血窦或巨核细胞的100微米范围内，其中66%的细胞距离血窦在25微米之内，凸显了HSC与这些生态位结构的紧密空间关联。

Jak2^V617F小鼠表现出改变的巨核细胞骨髓生态位

为验证该染色组检测病理变化的能力，研究人员将其应用于Jak2^V617F突变小鼠模型。与野生型对照相比，Jak2^V617F小鼠骨髓中c-Kit⁺和c-Kit⁺/Sca1⁺细胞数量显著增加，巨核细胞的数量和平均尺寸也明显增大，导致巨核细胞占据的骨髓面积扩大。同时，血窦覆盖的面积也显著增加，而小动脉面积无变化。关键的空间分析发现，Jak2^V617F小鼠中的c-Kit⁺/Sca1⁺细胞与巨核细胞的距离显著近于对照组。然而，当随机测量所有DAPI⁺细胞与巨核细胞的距离时，也观察到同样的接近趋势，表明这种效应主要源于巨核细胞密度增高导致的“拥挤”效应，而非c-Kit⁺/Sca1⁺细胞特异性地定位于巨核细胞附近。

研究结论与讨论

本研究成功建立并优化了一套用于小鼠FFPE骨髓多重空间成像的标准化流程。通过解决高自体荧光、组织易损等技术难点，开发了一个包含c-Kit、Sca1、CD41、endomucin等关键标志物的mIHC染色组。该方案能够在单张切片上同时解析造血干细胞及其周围的血管、巨核细胞、骨表面等生态位结构，并精确定量它们之间的空间关系。应用该技术于Jak2^V617F疾病模型，不仅复现了已知的细胞数量表型（如HSPC和巨核细胞增多），更首次在空间层面上揭示了疾病状态下骨髓生态位的重塑特征，特别是巨核细胞生态位的扩张以及所有骨髓细胞（包括恶性HSC）与其空间距离的缩短。

这项研究的重要意义在于填补了技术空白。它首次提供了针对小鼠FFPE骨髓——这种形态保存更佳、更易长期存储和获取薄切片的样本类型——的标准化、高质量多重空间分析方案。相较于已报道的基于冰冻切片的CODEX方案或其他依赖于新鲜样本的整体染色/透明化技术，本方案在成本、时效性和与大量历史FFPE样本库的兼容性上具有独特优势。所开发的染色组灵活可调，可根据具体科学问题扩展至7个标志物，为在空间背景下研究造血发育、稳态和疾病（如骨髓纤维化、白血病等）提供了一个强大而实用的工具。研究结果证实，即使在病理状态下生态位发生显著重塑（如巨核细胞增多症），HSC仍倾向于保持在特定的生态位结构附近，这为了解疾病微环境如何影响恶性克隆的维持和演进提供了新的空间维度证据。总之，这项工作将“从图片到洞见”的愿景向前推进了一步，使得研究人员能够更清晰、更全面地窥视骨髓“工厂”的内部布局，为深入理解造血调控和开发靶向微环境的治疗策略奠定了重要的方法学基础。