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为了解决在单分子水平上同步解析核小体DNA序列及其组蛋白修饰组合模式的难题，研究人员开发了名为SM-NucSeq的新技术。该技术将单分子免疫亲和检测与单分子实时(SMRT)测序相结合，利用零模波导(ZMW)在单分子水平上同时检测完整核小体的组蛋白修饰并对其关联的DNA进行测序。研究证实，与双链DNA对照组相比，核小体中的DNA合成速率降低，且速率图谱具有组蛋白修饰依赖性。这项工作为在单核小体水平上同时获取遗传和表观遗传信息提供了全新的单分子工具平台。
我们的细胞核内并非杂乱无章，DNA与组蛋白结合形成称为染色质的基本结构单元——核小体。这些核小体不仅是DNA的包装单位，其自身也承载着复杂的调控“密码”，即表观遗传标记。其中，组蛋白尾巴上发生的化学修饰，如甲基化、乙酰化等，是调控基因表达的关键开关。这些修饰的不同组合模式，被称为“组蛋白密码”，能精密调控染色质的结构松紧，从而决定特定基因的“开”与“关”，深刻影响着细胞的命运、发育以及疾病的发生。
然而，长久以来，解析这些修饰在单分子水平上的组合模式及其所对应的具体DNA序列，一直是一个巨大的技术挑战。主流的染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、CUT&RUN、CUT&Tag等方法虽然应用广泛，但它们本质上是对群体细胞平均信号的测量。就像一个合唱团，你只能听到整体的和声，却无法分辨出其中每位歌手的声音，更无法知道哪位歌手在唱哪句歌词。这些方法难以揭示单个核小体上特定组蛋白修饰的组合情况，也阻碍了我们理解多种表观遗传标记如何协同工作，以精细调控复杂的生物过程。
为了打破这一瓶颈，科学家们开发了一项创新技术。在最近发表于国际顶级期刊《Nano Letters》的一项研究中，研究人员成功开发了名为SM-NucSeq（单分子核小体测序）的新技术，旨在同步解读单个核小体的基因组序列和表观基因组“密码”。
为了达成这一目标，研究人员巧妙地结合了几项关键技术。首先，他们利用单分子实时(SMRT)测序的核心元件——零模波导(ZMW)。ZMW是一种纳米级的井状结构，能将激发光束限制在极小的体积内，从而实现单分子荧光检测。研究者构建了SM-NucSeq文库，制备了能保持结构完整的核小体SMRT环（Nuc-bells），使其能够被固定并进行测序。其次，他们结合了单分子免疫荧光检测技术，利用带有不同荧光标记的抗体，在ZMW中对固定核小体上的特定组蛋白修饰（如H3K27me3, H3K9ac, H3K4me3）进行实时成像和检测。最后，在完成组蛋白修饰检测后，在同一位置对核小体DNA进行SMRT测序，从而将表观遗传信息与其对应的DNA序列在单分子水平上直接关联起来。研究样本使用从HEK293细胞中提取的单核小体。
制备SM-NucSeq文库和用于SM-NucSeq的TIRF装置
研究人员首先构建了定制的微镜全内反射荧光显微镜(TIRF)。为了用SMRT测序化学方法对天然核小体DNA进行测序，他们优化了文库制备方案，制备了核小体SMRT环。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证实，优化后的连接方案成功生成了Nuc-bells，且组蛋白/DNA复合物在连接后得以保持完整。
核小体在ZMW上的固定和修饰检测
研究证实，核小体-聚合酶复合物可以通过链霉亲和素-生物素相互作用被固定到ZMW芯片上。利用荧光标记的抗体进行检测，在ZMW芯片上观察到了抗体与核小体的特异性结合与解离事件。实验结果显示，在ZMW芯片和生物素化盖玻片上，检测到携带H3K27me3修饰的核小体比例相近，证明了ZMW芯片用于单分子组蛋白修饰检测的可行性。
在TIRF显微镜上对ZMW中的核小体DNA进行测序
研究在ZMW中实现了对单核小体DNA分子的实时SMRT测序。他们开发了基于傅里叶级数拟合和聚类分析的算法，从荧光信号中解读DNA序列。更重要的是，他们成功观察到部分测序信号与一种或多种组蛋白修饰抗体信号共定位，为同步获取修饰与序列信息提供了概念验证。
在RS II测序仪上进行高通量实验
为了大幅提高通量，研究在配备了单分子荧光显微系统的商用PacBio RS II测序仪上进行了SM-NucSeq实验。他们利用该系统成功监测了抗体结合与解离的动态过程，并完成了高通量的核小体测序。数据分析显示，与DNA文库相比，核小体文库的平均聚合速率更慢。有趣的是，携带H3K9ac或H3K4me3修饰的核小体表现出略高的聚合速率，提示这些修饰可能通过改变组蛋白-DNA相互作用来帮助DNA解缠绕。
在RS II测序仪上进行双组蛋白修饰的SM-NucSeq检测
利用从HEK293细胞中提取的单核小体，研究发现9.7%的核小体带有H3K9ac修饰，5.8%带有H3K4me3修饰。值得注意的是，13.6%的H3K4me3标记核小体同时也带有H3K9ac修饰，反之亦然，证实了这两种活化标记在某些基因组区域的关联性。通过与公共ChIP-seq数据比对，研究成功定位了一些同时携带这两种修饰的“双价”修饰核小体。
研究结论与意义
该研究成功论证了利用零模波导(ZMW)在单分子水平上检测和定位组蛋白修饰的原理和可行性。相比传统的表观遗传学技术，SM-NucSeq利用单分子测序技术，为同步揭示遗传信息和组蛋白翻译后修饰提供了全新的路线图。尽管本研究尚未展示，但ZMW SMRT测序同样能够检测DNA甲基化，这为在单个核小体上同时生成组蛋白修饰和DNA甲基化的单分子数据提供了前景。作为一种单分子方法，SM-NucSeq还具有独特的优势，能够检测携带双重或多重修饰的“双价”或“多价”核小体，这对于研究组合性表观遗传效应至关重要。
研究还发现，与DNA相比，核小体的DNA复制速率更慢，而不同组蛋白修饰（如H3K9ac和H3K4me3）会影响这一速率。这为研究具有不同表观遗传特征的核小体周围DNA解缠绕的动态过程开辟了新的途径。这些概念验证实验展示了将ZMW测序技术从长读长DNA测序扩展为一个多路复用的遗传和表观遗传工具箱的巨大潜力。该平台的进一步发展，有望应用于研究染色质修饰复合物对染色质解缠和可及性的影响。总之，SM-NucSeq的建立为一个变革性的单分子平台，为在单分子、实时、高分辨率水平上研究染色质动力学、组合修饰和基因调控铺平了道路。
