《Tropical Animal Health and Production》：Molecular epidemiology of group A rotavirus (RVA) and bovine coronavirus (BCoV) associated with neonatal calf diarrhea in Türkiye
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为解决新生犊牛腹泻(NCD)中病毒病原的流行、分子特征及基因型多样性等问题，研究人员在土耳其各地针对213份腹泻犊牛（<28日龄）粪便样本，开展了A组轮状病毒(RVA)和牛冠状病毒(BCoV)的分子流行病学研究。结果发现，RVA和BCoV的流行率分别为32.3%和7.9%，混合感染率为1.8%。分子分型揭示了G10P[11]和G6P[5]为主要RVA基因型组合，并检测到罕见的G8P[5]和G6P[1]组合。BCoV毒株属于Beta冠状病毒属，与经典毒株相似。研究表明，尽管有疫苗和生物安全措施，遗传多样的RVA和相对保守的BCoV仍在共同传播，强调了根据流行毒株分子特征调整控制策略的必要性。
在畜牧业中，新生犊牛腹泻(Neonatal Calf Diarrhea, NCD)是一个老生常谈却始终严峻的经济“杀手”，它导致的高发病率、高死亡率、治疗成本以及长期生长迟滞，给奶业和肉牛生产者带来沉重负担。在众多元凶中，A组轮状病毒(Group A rotavirus, RVA)和牛冠状病毒(Bovine coronavirus, BCoV)是公认的两位“主角”，分别偏爱在犊牛生命的最初两周和5至20日龄发起攻击，有时还会与其他病原体“结伴作案”，加剧病情。尽管疫苗接种和生物安全措施已成为牧场的标准操作，但这两个病毒似乎“阴魂不散”，腹泻病例依然频频发生。这背后究竟隐藏着怎样的秘密？是因为疫苗“打不准”（与流行毒株不匹配），还是病毒在“暗中进化”，产生了新的变体？为了回答这些问题，一支研究团队将目光投向了横跨欧亚的土耳其，对这个国家新生犊牛腹泻中RVA和BCoV的“真面目”展开了一次深入探查，并将研究成果发表于《Tropical Animal Health and Production》杂志。
为了摸清这两种病毒在土耳其的“家底”，研究人员在2018年至2023年间，从土耳其不同地区的集约化和小型牧场收集了213份年龄小于28天的腹泻犊牛粪便样本。他们首先采用抗原ELISA试剂盒对RVA和BCoV进行快速筛查，初步锁定阳性样本。随后，对阳性样本进行了更精确的分子验证和深入分析：针对RVA，使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增其VP6基因进行确认，并进一步对决定病毒血清型的关键外衣壳蛋白基因VP7(G型)和VP4(P型)进行基因分型，以确定流行的基因型组合。他们还采用了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，通过观察病毒基因组11个片段的电泳迁移模式，确认了所有检测到的轮状病毒都属于典型的A组。针对BCoV，则采用巢式RT-PCR对其相对保守的核衣壳蛋白(N)基因进行扩增和确认，并对来自三个不同省份的代表性毒株进行了测序和系统发育分析，以确定它们的分类地位和遗传关联。
结果
抗原ELISA结果
在213份粪便样本中，ELISA检测结果显示，RVA单独阳性为65份(30.52%)，BCoV单独阳性为13份(6.10%)，两者混合感染为4份(1.88%)。至少一种病毒（RVA和/或BCoV）的检出率为38.5%。
RVA RT-PCR、G和P基因分型结果
在69份RVA ELISA阳性样本中，有53份通过靶向VP6基因的RT-PCR得到确认。基因分型结果显示，G6、G8、G10是主要的G基因型，P[1]、P[5]、P[11]是主要的P基因型。成功分型的样本中共鉴定出多种G/P组合，其中G10P[11]（18份）和G6P[5]（16份）是占主导地位的组合。值得注意的是，还检测到了在土耳其较为罕见的G8P[5]和G6P[1] 组合，以及包含混合G基因型（如G8+G10P[11]）的样本，这提示了毒株的多样性和可能的基因重配现象。
SDS-PAGE结果
对69份RVA ELISA阳性样本进行的SDS-PAGE分析显示，所有样本的病毒RNA基因组片段在凝胶上均呈现典型的4/2/3/2迁移模式，这是A组轮状病毒的特征性“指纹”，进一步从基因组结构上证实了这些病毒属于RVA。
BCoV巢式PCR结果和系统发育分析结果
在17份BCoV ELISA阳性样本中，有13份通过靶向N基因的巢式RT-PCR得到确认。对来自阿德亚曼、布尔萨和埃迪尔内三个省份的三个代表性毒株进行测序和系统发育分析。分析表明，这些土耳其的BCoV毒株全部归属于Beta冠状病毒属，并且与经典的BCoV毒株（如Mebus株）在遗传上高度相似，显示出较为保守的遗传特性。
研究的结论与讨论清晰地勾勒出一幅土耳其新生犊牛腹泻的病毒图谱及其深远含义。本研究表明，RVA和BCoV依然是土耳其新生犊牛腹泻中不可忽视的主要病毒病原，其流行率（RVA 32.3%， BCoV 7.9%）与全球及地区既往报告相符，证实了这两种病毒在当地养殖场中的持续活跃传播。这项研究的核心发现在于揭示了病毒的遗传多样性（针对RVA）和相对保守性（针对BCoV）并存的复杂局面。
在RVA方面，研究不仅确认了全球牛群中常见的G6、G10、P[5]、P[11]基因型的流行，更重要的是，首次在土耳其田间样本中检测到了G8P[5]和G6P[1]这类罕见组合，以及包含混合G基因型（如G8+G10）的毒株。这些发现如同投石入水，激起了层层涟漪：它强烈暗示，通过基因重配和可能的跨物种传播，RVA在土耳其的基因型多样性可能比以往认知的更为动态和丰富。这对现有的疫苗策略构成了直接挑战。目前常用的灭活多联疫苗通常包含G6P[1]、G10P[11]等经典基因型，但田间流行株中出现的G8P[5]等非疫苗包含型，以及即使在疫苗包含型（如G6P[1]）感染下仍出现腹泻的案例，都指向了疫苗株与流行株之间可能存在的抗原性不匹配。这或许能部分解释为何在实施免疫的牧场中，病毒性腹泻仍时有发生。
相比之下，基于N基因的分析显示，土耳其的BCoV毒株遗传上相对保守，聚类于经典的肠道致病株系，与疫苗常用Mebus株相似性高。这表明在N基因水平上，当前疫苗对BCoV可能仍具理论基础。然而，研究人员也谨慎指出，N基因相对保守，要评估毒株的精细变异、组织嗜性改变或毒力差异，需要分析刺突蛋白(S)等变异更高的基因区域。
在诊断方法学上，研究比较了ELISA和PCR，发现两者结果并非完全一致（部分ELISA阳性样本PCR未检出），这提示病毒的检出受感染阶段、病毒载量、样本中PCR抑制剂等多种因素影响。因此，在田间诊断中，结合使用抗原筛查（ELISA）和分子确认（PCR） 可能提供更可靠的结果。而SDS-PAGE作为一项传统技术，在本研究中成功在所有RVA ELISA阳性样本中检出特征性条带，甚至包括部分PCR阴性样本，彰显了其作为补充诊断方法的独特价值。
综上所述，这项来自土耳其的研究发出了明确的警示：新生犊牛腹泻的病毒战场形势仍在变化。RVA正通过基因的“排列组合”展现出意想不到的多样性，而BCoV则维持着表面下的稳定。这些发现强烈呼吁建立持续的分子流行病学监测网络，以实时跟踪流行毒株的遗传变迁。更重要的是，它强调了“一刀切”的疫苗策略可能已不足以应对复杂的田间情况，未来的腹泻防控必须走向精准化——即根据本地流行毒株的分子特征，动态评估和优化疫苗组分，同时将有效的初乳管理、严格的生物安全与靶向免疫紧密结合，形成立体的防御体系，从而真正降低新生犊牛腹泻对畜牧业可持续发展的威胁。
