《Advanced Healthcare Materials》：Bioengineered 3D hPSC-Cholangiocyte Ducts With Physiological Signals for Biliary Disease Modeling
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为弥补现有模型在复杂性和通量上的不足，以精确解析肝脏内胆管疾病的致病机制，研究人员构建了一种具有开放管腔、可灌注、全上皮化的三维人胚胎干细胞(hPSC)来源的胆管。该模型成功整合了流体剪切力、基质细胞、胆汁酸和炎症因子等多种生理/病理信号，揭示了它们对胆管上皮屏障功能、纤毛发生和极化的调控作用，为高通量研究胆管疾病病理机制和开发个体化疗法提供了强大平台。
肝脏内部的胆管网络虽然微小，却承担着输送和修饰胆汁的关键任务。当胆管发生病变，如原发性硬化性胆管炎(Primary Sclerosing Cholangitis, PSC)或原发性胆汁性胆管炎(Primary Biliary Cholangitis, PBC)时，胆汁淤积、炎症和纤维化会逐步摧毁肝脏，最终导致肝衰竭。然而，科学家们长期以来面临一个困境：我们无法在活体内直接触及并研究这些深藏于肝脏内部的胆管，而现有的实验室模型，无论是传统的二维培养还是类器官，都难以完整复现体内胆管复杂的微环境——包括持续流动的胆汁、多种基质细胞的支撑、以及特定浓度和组成的胆汁酸环境。这种“模型鸿沟”严重阻碍了我们对胆管疾病发生机制的理解和新疗法的开发。为了跨越这一障碍，一支研究团队在《Advanced Healthcare Materials》上发表了一项突破性研究，他们成功地在培养皿中“建造”出了功能更接近真实人体、并能接受多种生理信号“考验”的三维胆管。
研究人员运用了几个关键技术方法来构建和评估这一先进模型。首先，他们利用AngioPlate384高通量微流控平台，通过重力辅助接种和纤维蛋白水凝胶，构建了具有可灌注管腔的三维支架结构。其次，他们将高效分化为肝祖细胞(hPSC-HBs)的人多能干细胞(hPSC)接种到管腔内，并通过一套经过优化的分化方案（包含视黄酸等因子），将其诱导分化为胆管上皮细胞(hPSC-chol)，形成完整的胆管样结构。此外，为了模拟体内支持性微环境，他们将经过基因工程改造、过表达Jagged-1的OP9基质细胞(OP9j)或人干细胞来源的膈中胚层细胞(hPSC-STM)嵌入水凝胶中，与胆管细胞共培养。在功能评估方面，他们采用了多种严谨的分析手段：使用荧光标记的右旋糖酐灌注来定量评估上皮屏障完整性；通过免疫荧光染色和图像分析来检测细胞极性标志物（如CFTR、ZO-1）的定位以及初级纤毛的发生率；利用荧光成像平板读数器(FLIPR)测定CFTR通道介导的氯离子传导功能；并通过定量PCR分析关键功能基因和病理标志物的表达变化。
2.1 高效分化与三维hPSC-chol胆管的上皮化
研究人员在AngioPlate384平台中，成功将hPSC来源的肝祖细胞分化为覆盖管腔的胆管上皮。经过20天的分化，超过95%的细胞表达胆管细胞标志物细胞角蛋白7(CK7)，并且胆管成熟标志物CK7和CFTR的基因表达显著上调，而肝祖细胞标志物则下调，证明了高效的特化。免疫染色显示，分化成熟的胆管具有顶-基极性，顶端富集了紧密连接蛋白ZO-1和CFTR，并且管腔面形成了丰富的初级纤毛，这些是功能性胆管的关键特征。
2.2 流体剪切力增强hPSC-chol胆管的功能成熟
生理性的胆汁流动会产生流体剪切力。研究发现，与静态培养相比，在模拟生理流速（估计为0.26–0.45 mL/min）下的双向流体灌注，能显著增强胆管上皮的屏障完整性，减少大分子渗漏。同时，流体灌注将具有初级纤毛的细胞比例从27.4%提高至45.9%，并上调了纤毛相关基因(PKD1, PKD2)和平面细胞极性基因VANGL2的表达。这表明生理性流体剪切力是维持胆管上皮功能和极性的重要信号。
2.3 基质细胞掺入在流体剪切力下进一步促进hPSC-chol功能成熟
为了模拟胆管周围的间质支持，研究将经过辐照的OP9j细胞掺入水凝胶。结果显示，在流体灌注条件下，加入基质支持后，胆管上皮的屏障紧密性进一步增强，初级纤毛阳性率提升至约70%，相关基因表达也更高。更重要的是，该模型表现出CFTR依赖性的氯离子传导功能，经forskolin和ivacaftor (VX-770)刺激后活性显著增强，并通过蛋白质印迹证实了糖基化CFTR蛋白的表达，这综合证明了该三维胆管具备了接近真实胆管的分泌功能。
2.4 升高的胆汁酸水平破坏流体剪切力下的hPSC-chol上皮完整性
研究用六种主要的人胆汁酸（包括结合的GCA、GCDCA、TDCA和非结合的CA、CDCA、DCA）处理胆管，模拟慢性暴露。低浓度的某些胆汁酸（如GCDCA、TDCA）可增强屏障功能，而高浓度则会破坏屏障完整性，导致渗漏增加。特别是高浓度的非结合胆汁酸CDCA (0.25 mM)破坏力最强。当使用生理浓度的混合胆汁酸处理时，随着浓度升高，屏障破坏也越明显。这揭示了不同胆汁酸种类和浓度对胆管上皮完整性的双重和阈值效应。
2.5 炎症因子对hPSC-chol胆管的影响
研究人员测试了三种促炎细胞因子：IL-6、TNF-α和IFN-γ。其中，IFN-γ处理虽然不直接影响屏障，但能显著降低多种胆管功能基因（如CFTR、TMEM16A）的表达，并将初级纤毛阳性率从76.7%降至50.2%。值得注意的是，IFN-γ是唯一能显著上调胆汁酸受体TGR5和FXR基因表达的细胞因子，这可能意味着一种代偿或应激反应。
2.6 胆汁酸与炎症因子的联合效应
当胆汁酸与IFN-γ联合作用时，发现了协同损伤效应。对于结合型胆汁酸，IFN-γ能加剧GCDCA引起的屏障渗漏，且在中高浓度下，两者联合可进一步减少初级纤毛。分子层面，结合型胆汁酸的混合物能抑制IFN-γ诱导的TGR5和FXR上调。这些结果表明，在炎症背景下，胆汁酸能以种类和浓度依赖的方式，与细胞因子协同破坏胆管稳定。
2.7 利用增殖性基质细胞在hPSC-chol胆管中模拟胆道纤维化
当使用未辐照、可增殖的OP9j或hPSC-STM基质细胞时，它们会在胆管周围过度生长并包裹管腔，导致上皮屏障功能严重受损，同时上调胶原蛋白(COL1A1, COL6A1)和α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)等促纤维化基因，并下调CFTR表达，成功模拟了胆道纤维化的关键特征。而使用辐照后的同种基质细胞则能支持胆管功能而不引发纤维化，证明了基质细胞状态的决定性作用。
结论与意义
这项研究成功地构建了一个高度仿生、功能齐全且通量高的三维人源胆管模型。该模型的核心价值在于能够系统性地整合并剖析多种生理和病理信号（流体剪切力、基质支持、胆汁酸、炎症）对胆管细胞的独立与联合影响。研究得出几个重要结论：生理性流体剪切力和支持性基质是维持胆管上皮屏障、纤毛发生和极化的关键；胆汁酸对胆管完整性的影响具有浓度和种类特异性，存在从保护到破坏的阈值；炎症因子IFN-γ能单独损害胆管功能基因表达和纤毛发生，并能与特定胆汁酸协同加剧损伤；增殖活化的基质细胞可直接驱动上皮功能障碍和纤维化表型。
这项工作的重要意义在于，它超越了现有模型，提供了一个前所未有的平台，能够在接近生理的复杂环境中，精确解码胆管疾病（胆管病）的致病驱动因素。它不仅有助于区分疾病不同阶段（如早期功能障碍与晚期上皮毒性）的特征，为发现早期生物标志物提供了可能，而且其高通量特性兼容患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)的使用，为未来实现个性化药物筛选和开发精准医疗策略奠定了坚实的基础。最终，这个平台有望加速针对各种毁灭性胆管疾病的新疗法开发。
