基于核酸识别诱导的多重DNA释放及Exo III辅助的目标回收机制，实现对miRNA-155的电化学生物传感

《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Electrochemical biosensing of miRNA-155 based on nucleic acid recognition-induced multiple DNA release and Exo III-assisted target recycling

基于多放大策略的电化学传感器实现miRNA-155高灵敏检测，通过Exo III介导的靶标循环和双杂交机制，显著提升信号。该传感器检测限0.026 pM，线性范围0.1 pM-1 mM，适用于乳腺癌早期诊断。

王耀轩|王海燕|董宪川|隋静|张菲菲|王宗华

山东科技大学化学与化学工程学院、材料科学与工程学院、山东中日碳纳米材料合作研究中心、青岛光电生物传感临床诊断与治疗应用技术创新中心、青岛大学仪器分析中心，中国青岛市266071

摘要

本文提出了一种基于多重放大策略的miRNA-155检测方法，该方法包括核酸识别诱导的多重DNA释放和Exonuclease III（Exo III）辅助的目标回收。首先，使用cDNA-磁珠生物偶联物捕获目标miRNA，触发两种含有亚甲蓝（MB）的信使DNA（mDNAs）的释放。这一步有效地使释放的mDNAs-MB数量翻倍，从而增强了初始信号。随后，通过Exo III介导的切割作用回收目标miRNA，进一步释放更多的mDNAs-MB，进一步增强信号。最后，每个捕获探针（P1）被设计为与两个mDNAs-MB杂交，实现双重信号识别。结果，方波伏安法（SWV）测量到显著放大的MB峰电流。整个检测策略整合了三种协同放大机制：多重mDNAs的释放、Exo III辅助的目标miRNA回收以及mDNAs与P1的双重杂交。作为乳腺癌诊断的生物标志物，miRNA-155被用于评估该生物传感器的性能。所提出的电化学生物传感器表现出0.1 pM至1 mM的宽检测范围，并实现了0.026 pM的低检测限，证实了其高灵敏度和在癌症诊断中的潜在应用价值。

引言

微小RNA（miRNAs）是内源性非编码RNA分子，通常长度为18–25个核苷酸，在调节各种生理和病理过程（包括细胞增殖、基因表达和代谢）中起关键作用。大量研究表明，异常的miRNA表达与多种人类疾病（尤其是癌症）密切相关。例如，血液或细胞中特定miRNA（如miRNA-155）的水平异常与肿瘤发生和癌症进展有关。因此，miRNAs已成为早期癌症诊断和治疗监测的有希望的生物标志物。目前迫切需要开发快速、灵敏和准确的miRNA定量方法。[1]、[2]、[3]

传统的miRNA检测技术包括Northern印迹、实时定量PCR（qPCR）和DNA微阵列。[4]、[5]尽管这些方法在生物学应用中具有某些优势，但它们往往存在操作复杂、灵敏度有限和成本高等局限性。电化学生物传感器作为miRNA检测的替代方案具有明显优势，易于集成到便携式设备中，检测限低，动态范围广，并适用于癌症诊断[6]、[7]、心血管疾病[8]、[9]、[10]和药物评估[11]、[12]等现场检测应用。例如，Hunt和Slaughter开发了一种基于纸片的电化学传感器，用于检测转移性前列腺癌的非侵入性生物标志物miRNA-141，实现了2.15 fM的检测限、宽线性范围和15分钟的响应时间[13]。Ibeaho等人报道了一种使用MoS?单层和AuNPs的高灵敏度电化学生物传感器，用于选择性检测miRNA-122。材料协同作用提高了固定化和信号转导效率，实现了从10^-7到10 nM的无标记检测，检测限低至4.27 × 10^-9 nM[10]。Cimmino等人报道了一种快速灵敏的电化学方法，用于定量封装的miRNA-218，该方法使用了一种与目标完全互补的商用金印刷电极[14]。此外，Zhou等人构建了一种集成电化学纳米装置，用于实时监测单细胞中的miRNA-155和单步药物评估，突显了集成电化学纳米装置在追踪微RNA动态和促进新型抗癌疗法高通量筛选方面的潜力[15]。

为了提高检测灵敏度，已经开发了许多新的信号放大方法。这些方法包括滚环扩增（RCA）[16]、[17]、[18]、杂交链反应（HCR）[19]、[20]、链置换测定（SDA）[21]、[22]、基于酶的循环扩增[23]和基于能量转移的测定[25]。其中，基于酶的循环扩增因其特殊的放大功能及其适用于均匀液体而逐渐成为检测miRNAs的流行策略。根据先前的报道，双链特异性核酸酶（DSN）[24]、[26]、lambda-外切酶[27]、[28]、nickase[29]和DNA聚合酶[31]、[32]常用于基于酶的生物传感器中检测miRNAs。酶促信号放大是现代核酸分析的基础策略。在各种核酸酶中，外切酶III（Exo III）因其能够选择性水解平末端或凹陷双链DNA而特别值得注意，而对单链DNA或具有突出3′末端的结构活性显著降低。这一独特性质使Exo III成为构建高灵敏度和选择性生物传感平台的强大催化剂。其在miRNA检测中的应用已有充分文献记载。例如，Exo III已与DNA酶结合用于超灵敏的miRNA-21分析[33]，并与金属有机框架和DNA纳米结构结合，用于识别单碱基错配[34]。Exo III与CRISPR/Cas12a的结合使得开发出一种多功能现场诊断平台成为可能，能够检测阿托摩尔浓度的病毒RNA和miRNAs[35]。最近报道了一种新的方法，该方法利用Exo III辅助的催化电路与双重识别机制相结合[36]。该方法的传感探针设计巧妙，具有双环结构，可同时与miRNA上的两个目标位点结合，这种双重识别机制提供了极高的特异性，允许精确的目标区分，并通过Exo III介导的信号回收实现超灵敏检测。

基于这些进展，本文介绍了一种基于核酸识别诱导的多重DNA释放和Exo III辅助的目标回收的电化学生物传感器，用于检测miRNAs。在该传感平台上，两种含有亚甲蓝分子的信使DNA（mDNAs-MB）与磁珠上的miRNA互补链（cDNAs）杂交以捕获目标miRNAs。在目标存在的情况下，cDNAs与目标结合并释放mDNAs-MB。磁分离后，根据金电极表面的探针DNA（P1）检测释放的mDNAs-MB。整个过程中涉及三种信号放大策略：首先，一个cDNA与两个mDNAs-MB杂交，导致两个mDNAs-MB的释放，从而使信号放大。其次，通过外切酶切割反应回收目标miRNA，释放更多mDNAs-MB。最后，一个P1可以与两个mDNAs-MB杂交，从而通过方波伏安法（SWV）检测到双放大的MB氧化峰电流。为了评估该传感平台的性能，选择了miRNA-155作为模型目标，因为它在乳腺癌诊断中具有临床相关性。

材料与试剂

Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP，98%）、咪唑-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液购自Aladdin（上海，中国）。牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma Aldrich Trading Co., Ltd.（上海，中国）。N-(3-(二甲氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（上海，中国）。Exo III和羧基修饰的磁珠由Sangon提供

检测原理

如图1所示，miRNA-155的检测机制主要分为两个过程：一个是目标miRNA触发的mDNAs-MB（mDNA1-MB和mDNA2-MB）的释放，另一个是mDNAs-MB的双重捕获。图1A显示cDNA-mDNA复合物固定在磁珠表面，在miRNA-155存在下，cDNA可以与目标miRNA竞争杂交，从而释放mDNAs-MB。

结论

总之，本文构建了一种电化学平台，利用多重探针释放、酶促回收和双重杂交的协同放大效应，实现了miRNA-155的灵敏检测。该传感器表现出优异的分析性能，包括0.026 pM的检测限、对非目标序列的高选择性和良好的重复性。通过将单个结合事件有效转化为显著放大的电化学信号，

CRediT作者贡献声明

王耀轩：撰写——原始草稿、实验研究、数据分析。王海燕：撰写——原始草稿、实验研究、数据分析。董宪川：软件开发、实验研究、数据分析。隋静：方法学设计、数据分析。张菲菲：撰写——审稿与编辑、指导、方法学设计、资金获取、数据分析。王宗华：撰写——审稿与编辑、指导、实验研究。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢山东省自然科学基金（ZR2021MB069）的支持。