《Advanced Science》：RNF213 Is an Interferon-Stimulated Gene That Targets Influenza A Virus NP and Activates MDA5 to Restrict Infection
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本研究发现，RNF213是一个被干扰素(IFN)信号和甲型流感病毒(IAV)感染诱导的关键抗病毒干扰素刺激基因(ISG)。它通过其AAA+ ATP酶和E3连接酶结构域与MDA5相互作用，促进MDA5在Lys137和Lys743位点的K63连接的多聚泛素化，从而放大干扰素产生。同时，RNF213还介导病毒核蛋白(NP)的K48连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解。该研究揭示了RNF213在连接先天性免疫激活与直接病毒限制中的双重作用机制，为抗流感治疗提供了新的潜在靶点。
流感，这个每年都会卷土重来的呼吸道“捣蛋鬼”，不仅给全球公共卫生带来持续威胁，其“变装”速度更是令人头疼。当前的疫苗和抗病毒药物，常常因为病毒的快速进化而“失灵”，出现免疫逃逸和耐药性问题。面对这场“猫鼠游戏”，科学家们将目光转向了我们身体内部——宿主自身的先天性免疫系统。当病毒入侵，我们的细胞会启动“警报系统”，产生干扰素(Interferon, IFN)并上调数百个干扰素刺激基因(Interferon-Stimulated Genes, ISGs)，它们像一支“特战队”一样，从各个层面阻击病毒。然而，这支“特战队”的成员名单和作用机制，尤其是针对甲型流感病毒(Influenza A Virus, IAV)的，我们仍未完全掌握。在这支“特战队”中，有一个名叫RNF213的成员格外引人注目。它是一个分子量高达591 kDa的E3泛素连接酶，最初被发现是烟雾病(Moyamoya Disease)的易感基因。后续研究发现，RNF213在抵抗多种病毒、细菌和寄生虫感染中都扮演着重要角色，但它是否以及如何对抗流感病毒，仍是一个未解之谜。为了回答这个问题，研究人员开展了一项深入研究，相关成果已发表在《Advanced Science》期刊上。
为了探索RNF213在抗流感病毒免疫中的作用，研究人员综合运用了多种关键技术。他们利用RNA测序(RNA-seq)技术在A549细胞中筛选并鉴定出被I型和II型IFN共同诱导的ISGs。通过细胞水平的过表达和siRNA敲低、小鼠感染模型等体内外功能实验，验证了RNF213的抗病毒活性。在机制探索层面，他们采用荧光素酶报告基因检测、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)、免疫荧光共定位、蛋白质印迹(Western Blotting)、以及His标签下拉(His Pull-Down)等实验，揭示了RNF213与关键免疫信号分子（如MDA5）及病毒蛋白（NP）的相互作用。此外，通过泛素化实验和定量泛素化修饰蛋白质组学分析，他们精准定位了RNF213催化的特定类型泛素化修饰位点（如K63和K48连接的多聚泛素化）。
3.1 在A549细胞中鉴定IFN-α和IFN-γ处理后的ISGs
研究人员用I型干扰素(IFN-α)和II型干扰素(IFN-γ)处理A549细胞，进行转录组分析。他们发现了242个被两者共同诱导的ISGs，其中就包括RNF213，从而首次确认了RNF213是A549细胞中一个经典的干扰素刺激基因。
3.2 RNF213的表达被IFN处理和IAV感染诱导
实验证明，在A549和HEK293T细胞中，用IFN-α或IFN-γ处理能以时间和剂量依赖性的方式显著上调RNF213蛋白水平。同时，病毒模拟物poly(I:C)的转染以及IAV (PR8株)的感染，也能诱导RNF213的表达。这证实RNF213的表达确实受到IFN信号和病毒感染的调控。
3.3 RNF213抑制IAV复制
功能实验发现，在A549细胞中过表达RNF213，能显著降低流感病毒的滴度和病毒核蛋白(NP)的mRNA水平。相反，用特异性siRNA敲低RNF213的表达，则会增加病毒NP蛋白的水平。这表明RNF213在细胞水平上具有明确的抗流感病毒活性。
3.4 RNF213基因敲除(KO)小鼠对流感病毒感染更易感
研究人员构建了RNF213基因敲除小鼠模型。与野生型(WT)小鼠相比，感染PR8病毒的RNF213 KO小鼠体重下降更严重、死亡率更高、肺组织病毒载量显著升高、肺组织损伤也更重。同时，KO小鼠肺组织中干扰素-β(IFN-β)的mRNA表达，以及信号通路关键蛋白磷酸化IRF3(p-IRF3)和磷酸化TBK1(p-TBK1)的激活均受到抑制。这表明RNF213是宿主体内防御流感病毒感染所必需的。
3.5 RNF213正向调节RLR介导的IFN-β信号通路
报告基因实验显示，过表达RNF213能显著增强由poly(I:C)诱导的IFN-β启动子活性。敲低RNF213则会抑制poly(I:C)诱导的p-IRF3和p-TBK1的激活。这些结果表明，RNF213是RLR信号通路的一个正向调节因子。
3.6 RNF213靶向MDA5
进一步的机制研究发现，RNF213能选择性地与模式识别受体MDA5相互作用，但不能与RIG-I、MAVS、TBK1或IRF3相互作用。在病毒感染或poly(I:C)刺激下，内源性的RNF213也能与MDA5结合。功能上，RNF213能显著增强MDA5介导的IFN-β报告基因活性和IRF3磷酸化，而对其他信号分子（如RIG-I）的激活无明显影响。这明确了RNF213的作用靶点是MDA5。
3.7 RNF213通过其AAA+ ATP酶和E3连接酶结构域结合MDA5
通过构建RNF213的截短体突变体，研究人员发现MDA5与RNF213的AAA+ ATP酶结构域和E3连接酶结构域均有相互作用，而与Narm结构域无关。同时，MDA5的CARD和Helicase结构域对于与RNF213的结合也至关重要。功能缺失突变实验证实，这两个结构域对RNF213增强MDA5驱动的IFN表达必不可少。
3.8 RNF213促进MDA5泛素化
RNF213是E3泛素连接酶。研究发现，过表达RNF213能增强MDA5的K63连接的多聚泛素化，而敲低RNF213则降低其泛素化水平。这种促进作用依赖于RNF213的AAA+ ATP酶和E3连接酶结构域。此外，RNF213还能促进ISG15与MDA5的结合。
3.9 RNF213促进MDA5在Lys137和Lys743位点的泛素化
通过系统性的点突变筛选，研究人员锁定了MDA5上两个关键的赖氨酸位点：Lys137和Lys743。将这两个位点突变为精氨酸(R)后，RNF213对MDA5的泛素化增强作用以及对MDA5介导的IFN-β信号激活的促进作用被显著削弱或完全消除。这证明K137和K743是RNF213介导MDA5 K63连接多聚泛素化的关键位点。
3.10 RNF213泛素化并降解病毒NP
除了调节宿主免疫，研究人员还发现了RNF213直接攻击病毒的“第二重”机制。他们通过对感染PR8病毒的野生型和RNF213 KO小鼠肺组织进行定量泛素化蛋白质组学分析，发现了病毒蛋白（包括NP）上的泛素化修饰位点。实验证实，RNF213能与病毒NP蛋白直接相互作用，并介导NP的K48连接的多聚泛素化，从而导致其通过蛋白酶体途径被降解。蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转RNF213对NP的降解作用。
在讨论与结论部分，该研究系统性地揭示了RNF213在抗流感病毒免疫中的双重角色，构成了一个精巧的“攻防兼备”的防御体系。一方面，RNF213扮演“免疫放大器”的角色。作为被IFN和病毒诱导的ISG，它通过其E3泛素连接酶活性，靶向先天性免疫信号通路中的关键传感器MDA5，催化其发生K63连接的多聚泛素化（特别是在Lys137和Lys743位点）。这种修饰增强了MDA5的稳定性和活性，从而放大了下游的I型干扰素反应，在感染早期建立起广泛的细胞抗病毒状态。另一方面，RNF213还是一位“病毒狙击手”。它能够直接识别并结合流感病毒的核心蛋白NP，并为其添加上K48连接的多聚泛素链“标签”，将其送往蛋白酶体进行销毁。NP的降解直接破坏了病毒基因组的复制和组装，从根源上遏制病毒增殖。这项研究的重大意义在于，首次将RNF213定义为抗流感病毒的关键ISG，并阐明了其通过“激活宿主免疫（MDA5） 直接降解病毒（NP）”的双重机制来发挥作用的完整路径。这不仅深化了我们对宿主-病毒相互作用复杂性的理解，更重要的是，RNF213本身成为了一个极具潜力的抗病毒药物研发新靶点。针对RNF213或其作用通路的调控，有望未来开发出既能增强机体自身免疫力，又能直接消灭病毒的新型“双效”抗流感疗法，为应对不断演变的流感病毒威胁提供新的策略和希望。
