《Advanced Science》：RENAL-CHIP: Rejection Evaluation via Non-Invasive Analysis of Circulating Podocytes With Herringbone-Chip Isolation Platform
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本研究针对肾移植后免疫排斥（acute rejection）缺乏无创精准诊断方法的临床难题，探索了供体来源的循环足细胞（CPCs）作为新型液体活检标志物的潜力。研究人员构建了一种磁可逆鲱鱼骨芯片（RENAL-Chip），可高效捕获外周血中的CPCs。在65名参与者中，该技术实现了对移植排斥的无创、精准诊断（AUC=1.0），并通过FISH和单细胞RNA测序阐明了排斥相关的分子机制，为术后监测和个体化治疗提供了有力工具。
肾移植是治疗终末期肾病的有效方法，但移植物能否长期存活，常常要过“排斥反应”这一关。目前，诊断移植肾是否发生排斥的金标准是肾穿刺活检，但这项操作是有创的，可能带来出血、感染等风险，且存在取样误差。另外，临床上常用的血清肌酐等指标，又容易受到其他非肾脏因素的干扰，不够精准。有没有一种方法，能像抽血检查一样方便、无创，又能精准预警排斥反应呢？这正是本研究试图攻克的核心难题。
近年来，液体活检技术（在血液等体液中检测循环生物标志物）在肿瘤等领域大放异彩。在肾移植领域，供体来源的游离DNA（dd-cfDNA）已被证明有潜力，但其本身浓度低、片段化高，检测也面临挑战。于是，科学家们将目光投向了另一种可能的“信使”——循环足细胞。足细胞是肾小球滤过屏障的关键守卫，在免疫损伤等因素下会从基底膜脱落。研究人员假设，这些脱落的供体来源足细胞会进入外周血，成为指示移植排斥的独立预测因子。为了验证这一设想，并实现高效捕获与深度分析，研究人员在《Advanced Science》上发表了他们的研究成果。
为开展本研究，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，自主设计并制备了磁可逆鲱鱼骨微流控芯片（RENAL-Chip），利用EpCAM抗体修饰的磁珠特异性捕获外周血中的循环足细胞。其次，利用免疫荧光染色（标记PODXL、EpCAM、CD45）对捕获细胞进行鉴定与计数。临床样本来源于厦门大学附属翔安医院伦理委员会批准的65名志愿者（包括健康供者、肾炎患者及肾移植受者）。接着，通过荧光原位杂交（FISH）技术，在性别不匹配的移植受者中验证了CPCs的供体来源。最后，对微量捕获的CPCs进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和生物信息学分析，以揭示其转录组特征。
2.1 RENAL-Chip的工作原理
为了从大量血细胞背景中高效捕获极微量的CPCs，研究团队设计了RENAL-Chip。其核心是在鲱鱼骨沟道结构上，利用外部磁场引导EpCAM抗体功能化的磁珠自组装成三维链，增加抗体表面密度。血液流经时，鲱鱼骨结构产生的涡流能将稀有细胞反复扫向捕获界面，从而实现高效、特异性捕获。移除磁场后，可用温和条件将活细胞无损释放，用于下游分析。
2.2 CPC Capture and Release Performance of RENAL-Chip
通过使用模型细胞系（HK2和CCRF-CEM）对芯片性能进行优化与评估。在最佳条件下（60 μg免疫磁珠，流速2.0 mL/h），芯片在缓冲液和全血中均能高效捕获靶细胞（对HK2细胞捕获效率达84.40% ± 1.87%），且非特异性吸附低。捕获的细胞可被高效释放（释放效率95.50% ± 0.71%），并保持高活力（96.04% ± 1.40%）和较好的纯度，释放后的细胞仍能正常生长，证明了其适用于下游分析。
2.3 Identification and Quantification of CPCs for Renal Transplant Rejection Monitoring
利用RENAL-Chip对65例临床外周血样本进行分析，通过免疫荧光鉴定PODXL+/EpCAM+/CD45-细胞为CPCs。结果显示，发生排斥的肾移植受者（RP组）外周血中CPCs数量（8-73个/mL）显著高于移植功能稳定者（SP组）及非移植个体（0-1个/mL）。以35个CPCs/mL为截断值，可完美区分SP与RP组（AUC = 1.0），证明了CPCs计数对肾移植排斥具有极高的诊断价值。
2.4 Identification of CPC Origin Through Chromosome Analysis
为确认捕获的CPCs来源于供体肾脏，研究人员对5例性别不匹配的移植受者样本进行FISH分析，检测CPCs的性染色体。结果发现，在男性受者中，其CPCs仅表达X染色体（供体为女性），而其自身白细胞（WBCs）表达X和Y染色体；在女性受者中，其CPCs表达X和Y染色体（供体为男性），而其自身WBCs仅表达X染色体。这直接证明了所捕获的CPCs确实来源于移植肾，而非受者自身。
2.5 scRNA-Seq Reveals the Role of Immunity in Renal Transplant Rejection
通过对排斥组与非排斥组患者分离的CPCs进行单细胞RNA测序，揭示了排斥反应的分子机制。结果显示，与稳定组相比，排斥组CPCs中足细胞损伤相关基因（如CHEK1、GBP1、CDK6、SLC9A6、USP38）和免疫激活相关基因（如CDK6、IL16、NFATC1、SGK1）显著上调。基因富集分析表明，差异表达基因显著富集于与先天免疫和适应性免疫相关的通路。其中，先天免疫相关通路如C型凝集素受体信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性被显著激活。同时，也富集到了同种异体移植排斥、Th17细胞分化和T细胞受体信号通路等适应性免疫相关通路。这表明先天免疫与适应性免疫在肾移植排斥中协同发挥作用。10 (n + 1), where n is the raw transcript count. (B) Heatmap depicting the expression of representative signature genes in CPCs from rejection and non-rejection groups. (C) Volcano plot highlighting differentially expressed genes between rejection and non-rejection groups in CPCs. Significantly upregulated or downregulated genes (|fold change| > 1 and padj < 0.05) are colored in red or blue, respectively. (D) GO analysis highlighting significant biological processes (BPs) and molecular functions (MFs). The GO terms highlighted in red are associated with innate immunity. (E) KEGG pathway enrichment analysis of isolated CPCs, highlighting the role of immunity in renal transplant rejection. Pathways highlighted in red are associated with innate immunity, whereas those highlighted in blue are related to adaptive immunity.">
本研究成功开发了一种基于磁可逆微流控界面（RENAL-Chip）捕获并分析循环足细胞（CPCs）的非侵入性肾移植排斥诊断新方法。该方法不仅将CPCs确立为监测免疫排斥的强大生物标志物，其诊断性能（AUC=1.0）优异，而且通过FISH确证了CPCs的供体来源，为无创诊断提供了直接证据。更重要的是，借助单细胞测序技术，研究首次在CPCs单细胞水平揭示了肾移植排斥过程中，足细胞损伤基因与免疫激活（特别是先天免疫通路，如NF-κB、TNF、NOD样受体信号通路）基因的共同上调，阐明了先天与适应性免疫协同驱动排斥反应的分子机制。
该研究的核心意义在于，它为解决肾移植术后无创、精准监测的临床难题提供了一种极具前景的全新策略。相较于有创的肾活检，该方法仅需1毫升外周血，即可实现高效、特异的细胞捕获与高活性回收，为下游的分子机制研究和潜在的个体化治疗指导奠定了基础。尽管CPCs在血液中的低丰度、单细胞测序成本较高等挑战仍待解决，但此项技术为变革移植后监护、实现及时干预以降低移植物失功风险、改善患者预后带来了新的希望。
