《Life Sciences》：Investigating gut microbiome dysbiosis in adults with chronic kidney disease: Diabetes-induced alterations via metagenomics and qPCR
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糖尿病肾病患者及健康人群肠道菌群多样性差异及关键菌群分析。采用16S rRNA测序结合qRT-PCR验证，发现Bacteroidetes uniformis、Ruminococcus等菌属丰度显著升高与肾功能恶化相关，而Bifidobacterium adolescentis等有益菌丰度下降，揭示肠道菌群失调与糖尿病肾病进展的动态关联。
Saranya Gunasekaran Rajalakshmi | K. Ramesh Babu | Pragasam Viswanathan
肾脏研究实验室，Pearl研究园区，生物科学与技术学院，Vellore理工学院，Vellore，632 014，泰米尔纳德邦，印度
摘要
背景
2型糖尿病（T2D）是糖尿病肾病的主要诱因，而糖尿病肾病又是慢性肾病（CKD）的首要原因。本研究采用16S rRNA宏基因组学方法，结合qRT-PCR和临床数据验证，探讨了健康个体与患有或不患有CKD的糖尿病患者肠道微生物群落的失调及组成变化，以识别与疾病进展相关的关键微生物属。
方法
对22名个体的粪便样本进行16S rRNA扩增子测序，以评估肠道微生物群的组成。通过差异丰度分析（LEfSe）和基于网络的方法（如随机森林）来识别关键微生物类群，并通过qRT-PCR验证这些结果。此外，还结合了皮尔逊相关性分析（Pearson correlation）、WGCNA（全基因组网络分析）、随机森林（random forest）和倾向得分匹配（propensity score matching）等方法，将微生物特征与临床指标关联起来。使用PICRUSt2工具预测了微生物途径的功能富集情况。
主要发现
共鉴定出1409个扩增子序列变异（ASVs）。Bray-Curtis差异性分析显示，患病组与健康组的微生物多样性存在显著差异（p < 0.031）。与肾小球滤过率（eGFR）和血清肌酐（sCr）相关的关键微生物包括Bacteroidetes uniformis（LFC +9）、Ruminococcus（LFC +8.1）和Dialister succinatiphilus（LFC +6.7），这些微生物与疾病进展和代谢调节有关。相反，具有保护作用的微生物如Bifidobacterium adolescentis（LFC -9.5）、Faecalibacterium prausnitzii（LFC -6.39）、Collinsella和Megasphaera elsdenii的数量减少。通过综合多种方法（皮尔逊相关性分析、WGCNA、倾向得分匹配和随机森林分类），发现了与临床协变量相关的微生物特征。
意义
我们的研究发现，肠道微生物群的改变在无CKD的糖尿病患者中就已经开始出现，但在患有CKD的糖尿病患者中更为明显，其中有益细菌的比例较低，这反映了疾病进展过程中微生物平衡的逐渐失调。
引言
糖尿病相关的慢性肾病（DCKD）已成为全球主要的健康危机，导致疾病发病率和死亡率上升[1][2]。长期的高血糖水平会严重损害肾脏血管和肾单位，显著增加慢性肾病（CKD）的风险[3]。大约80%的糖尿病患者、高血压患者或同时患有这两种疾病的人患CKD的风险增加。仅糖尿病本身就占所有CKD病例的10-67%[1][2]。特别是2型糖尿病，由于其发病较早且病情更严重，患CKD的风险比1型糖尿病高40%。然而，2型糖尿病的症状通常发展缓慢，这使得早期检测变得复杂，因此需要提高公众意识并及时干预。传统的生物标志物（如蛋白尿增加、血清肌酐升高和肾小球滤过率降低）常用于DCKD的评估[3][4][5][6][7]。尽管这些标志物能反映疾病晚期的情况，但在肾脏生理学研究中的应用往往会产生矛盾的结果。多项研究指出，DCKD患者之间的这些标志物存在差异。例如，一些患者虽然出现蛋白尿和蛋白尿与肌酐比值（ACR）升高，但这些变化并不总是与eGFR的变化相关[8][9][10]。此外，也有eGFR降低但无蛋白尿的情况，进一步增加了临床解读的难度[11][12][13]。鉴于CKD进展的复杂性和多因素性，仅依靠这些方法可能无法全面反映疾病动态。因此，人们对肠道微生物群失调作为理解宿主-微生物相互作用的整体性方法产生了兴趣，这为DCKD的早期诊断和预防策略提供了潜力。
研究表明，与真核生物和古菌相比，细菌是人体肠道中最丰富的微生物[14]。结肠中的细菌密度尤其高，每克肠道内含有10^10至10^11个细菌[15]。这些细菌通过分解宿主肠道中未消化的碳水化合物产生乙酸、丁酸和丙酸等代谢物，供宿主利用[16]。宿主通过维持肠道微生物群的稳定，形成了互利关系。然而，疾病、药物（包括抗生素）、营养缺乏或饮食变化等压力因素会严重破坏这种微妙的平衡。
在正常情况下，肠道内存在多种有益细菌，它们通过促进消化、合成维生素和抵御有害病原体来维护宿主的整体健康。当暴露于压力因素时，这种平衡会被打破，导致有益细菌减少和有害病原体过度生长。这种失衡（称为微生物群失调）与多种健康问题相关，包括胃肠道疾病、代谢性疾病以及糖尿病和慢性肾病等慢性疾病。鉴于肠道微生物群在维持健康中的关键作用，追踪这些微生物变化可以作为早期疾病检测的生物标志物。因此，监测肠道微生物群失调可以作为一种预警系统，帮助临床医生在疾病恶化之前识别潜在的健康问题。尽管已有研究在不同人群中探讨了DCKD患者的肠道微生物群变化，但将16S扩增子宏基因组学与基于qPCR的验证方法相结合的研究仍较为有限。因此，我们开展了一项初步研究，强调这项研究的重要性，通过宏基因组学方法检测肠道微生物群的相对丰度，并利用qPCR方法进行定量分析，同时通过倾向得分匹配和随机森林分类检查肠道微生物群与临床变量的关联，以识别与糖尿病患者CKD进展相关的特定微生物群特征。
人类志愿者招募和样本收集
本研究于2020年在印度泰米尔纳德邦的金奈Sri Ramachandra医学院和Vellore的肾脏护理和糖尿病中心招募了45-70岁的人类志愿者。该研究得到了Vellore人类伦理委员会（IECH）根据1975年赫尔辛基宣言的原则的科学和伦理批准（VIT/IECH/X/2021/04）。
结果
本研究共有15名患者（DNCKD：n = 10，DCKD：n = 5）以及7名健康对照组。对钠、钾、碳酸氢盐、总胆固醇和体质指数等临床变量的统计均值标准误差的评估显示，健康组和疾病组之间没有显著差异。然而，某些临床标志物（如血清肌酐（sCr）、HbA1c和C反应蛋白（CRP）在疾病组中显著升高（p < 0.001）。
讨论
肠道微生物群失调会引发炎症反应，原因是肠道通透性增加、肠上皮细胞功能障碍以及代谢过程紊乱[37][38][39]。因此，寻找基于微生物的标志物是非侵入性诊断和个性化治疗计划的可行途径。多项文献表明，糖尿病[40]和肾脏疾病[41][42]与肠道微生物群的变化有关。
研究的局限性
尽管研究结果令人鼓舞，但仍存在一些局限性。样本量相对较小（尤其是DCKD病例数量较少，n = 5），这可能降低捕捉个体间肠道微生物群多样性和变异性的统计能力，从而限制了结果的普遍性。尽管采取了谨慎的临床匹配和明确的选择标准，但仍无法完全避免某些混杂因素。
结论
总体而言，患有和未患慢性肾病的糖尿病患者的肠道微生物群组成存在差异。通过宏基因组学技术、qRT-PCR以及随机森林分类，我们发现了与DNCKD和DCKD相关的关键微生物特征。这些发现可能与糖尿病患者的肾脏疾病进展风险相关，但需要进一步验证。
CRediT作者贡献声明
：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、方法学设计、数据分析、概念构思。
：撰写、审稿与编辑、数据可视化、软件应用、方法学设计。
：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证、研究监督、资金获取、数据分析、概念构思。
伦理批准和参与同意
本研究遵循了所有机构指南和程序，并获得了VIT/IECH/X/2021/04号文件的伦理委员会批准。所有参与者的参与均为自愿，并已获得知情同意。
资助
本研究得到了Vellore理工学院（Vellore 632014）和印度医学研究委员会（ICMR-BMI/11(21)/2022，新德里）的支持。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益和个人关系可能被视为潜在的利益冲突：Saranya R Gunasekaran表示获得了Vellore理工学院的财务支持；她与印度医学研究委员会存在关系，包括资金资助。其他作者均声明没有已知的财务利益或个人利益冲突。
致谢
作者感谢金奈的Sri Ramachandra医学院和泰米尔纳德邦Vellore的肾脏护理和糖尿病中心在样本收集和临床数据提供方面的协助。同时，作者还感谢浦那的国家细胞科学中心（National Cell Centre for Science）对样本的测序工作，以及印度医学研究委员会（ICMR-BMI/11(21)/2022，新德里）的财务支持。
