《Aggregate》：Unexpected Discovery of Structure-dependent Aggregation of N-Oxide Enables Novel Heme-detecting Probes
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为解决传统血红素检测方法易受干扰、灵敏度不足及使用有毒试剂等问题，研究人员针对N-氧化物（N-oxide）的结构依赖性聚集特性开展了系统研究。他们通过高分辨质谱、聚集诱导发光（AIE）和扫描电镜等技术验证了4-哌啶基苯基N-氧化物可诱导聚集，并基于此设计开发了新型AIE探针FMO。该探针能以“点亮”模式高特异性、高灵敏度地检测血红素（Heme）和血红蛋白，在微摩尔范围内具有良好的线性关系，成功用于区分溶血模型小鼠，为溶血性疾病的诊断提供了新工具，也为N-氧化物在生物医学领域的应用开辟了新视角。
在生物医学领域，精准检测生物标志物是疾病诊断和研究的基石。血红素（Heme）作为一种关键的含铁卟啉复合物，不仅是血红蛋白、肌红蛋白等蛋白的核心辅基，其游离形式也与多种炎症反应和组织损伤相关，尤其是在溶血性疾病中，血红素水平的准确监测至关重要。然而，传统的检测方法，如基于特定波长（如400 nm）吸光度的分光光度法，往往容易受到胆红素、脂质等内源性物质的干扰。一些电导率法结果又受血液电解质浓度影响，而国际血液学标准化委员会推荐的氰化高铁血红蛋白法虽然权威，却涉及剧毒试剂。此外，已报道的一些基于N-氧化物或内过氧化物氧化还原活性的荧光或化学发光探针，检测范围通常较窄，这在一定程度上是由于高浓度血红素对荧光信号产生的猝灭效应。那么，有没有一种方法能够巧妙地规避这些干扰，实现更灵敏、更安全的血红素检测呢？
与此同时，化学家们对一类名为N-氧化物（N-oxide）的分子也充满了好奇。这类化合物含有一个高度极性的N+–O?配位键，这种两性离子特性使其具有高水溶性、氧化还原敏感性等独特性质。这些性质使N-氧化物在生物医学和材料科学中展现出巨大应用潜力，例如作为前药的还原触发基团，或用于构建防止蛋白质和细胞非特异性吸附的抗污染聚合物表面。一个普遍的认知是，N-氧化物因其高极性通常起到增加溶解度的作用。然而，一个有趣且被忽视的现象是，某些结构的N-氧化物是否也能促进分子聚集，而非仅仅溶解？如果存在这种结构依赖的聚集效应，能否将其转化为一种检测信号的开关机制，用于开发新型的生物传感器？
近期，一项发表于《Aggregate》的研究，正试图解开这个谜题，并基于此开发了革命性的血红素检测新方法。研究者们从一个意想不到的观察开始：在分析模型化合物4-哌啶苯甲醇（(4-piperidinophenyl)methanol）及其N-氧化物衍生物的高分辨质谱时，意外发现N-氧化物衍生物出现了二聚体[2M + H]+和三聚体[3M + Na]+的簇离子信号，而其脱氧的母体化合物则仅有单体信号。这暗示着N-氧化物基团可能通过静电引力促进了分子间聚集。为了验证这一假设，研究团队巧妙地将N-氧化物与聚集诱导发光（AIE）分子——四苯基乙烯（TPE）衍生物相结合。AIE分子在分散状态下荧光微弱，而在聚集或固态下荧光显著增强，是感知分子聚集状态的理想“指示剂”。
研究者合成了多种N-氧化物修饰的AIE探针及其脱氧还原产物，包括FBO、FNO、FPO等。通过系统比较它们的荧光光谱、水溶性、粒径、Zeta电位，并利用扫描电子显微镜观察形貌，他们获得了确凿的证据。研究发现，当N-氧化物通过苄氧基与TPE核心连接时（如FBO、FNO），尽管其极性比对应的脱氧产物（FB、FN）更高，但却表现出更强的聚集倾向和更高的荧光强度。反之，当N-氧化物（哌啶N-氧化物）直接连接到TPE核心时（如FPO），其增加溶解度的效应占主导，导致其在水溶液中的荧光强度反而低于其脱氧产物FP。这清晰地证明了N-氧化物诱导的聚集行为是结构依赖性的。
基于对N-氧化物“聚集”与“溶解”双重效应的深入理解，研究者构思了一种全新的检测策略：利用血红素催化还原N-氧化物，使原本高度可溶、低背景荧光的探针（如FMO）转变为水溶性降低、易于聚集的还原产物（如FM），从而实现从“暗”到“亮”的荧光信号转变。这一策略巧妙地利用了血红素的氧化还原活性，并将检测信号与聚集诱导发光效应耦合，有望克服传统荧光探针因血红素猝灭效应而导致的检测范围窄的问题。
为开展这项研究，研究人员综合运用了多项关键技术方法。在高分辨质谱中，他们首次观测到了模型N-氧化物化合物的二聚体和三聚体信号。随后，他们利用聚集诱导发光技术，通过比较N-氧化物探针与其脱氧产物的荧光强度和光谱变化，直观验证了N-氧化物诱导聚集的现象。通过动态光散射技术和Zeta电位测量，他们量化了探针及其还原产物的粒径和表面电势，进一步证实了聚集趋势。扫描电子显微镜则提供了探针在缓冲液中形成聚集体的直观形貌证据。在探针性能评估中，研究人员通过高效液相色谱和质谱联用，追踪了探针与血红素反应后产物的生成，明确了反应机制。最后，他们通过构建苯肼诱导的溶血小鼠模型，采集小鼠血浆样本，对探针FMO在复杂生物样本（稀释后的血浆）中的实际检测性能进行了验证，并与商业化的基于吸光度的血红素检测试剂盒进行了比较。
以下是对研究结果的简要归纳：
2.1 意外发现N-氧化物的聚集现象：通过高分辨质谱分析，首次观察到模型化合物4-哌啶苯甲醇N-氧化物在质谱中显示出二聚体和三聚体信号，而其脱氧形式没有，这引发了N-氧化物可能促进分子间聚集的假设。
2.2 通过AIEgens验证N-氧化物的结构依赖性聚集：设计与合成了一系列N-氧化物修饰的AIE探针。研究发现，当N-氧化物通过苄氧基连接臂与TPE核心相连时（FBO， FNO），其诱导聚集的能力更强，导致荧光强度高于其脱氧产物。而当N-氧化物直接连接时（FPO），则主要表现出增溶效应，荧光更弱。动态光散射、Zeta电位和扫描电镜结果均证实了FBO和FNO在水溶液中形成了尺寸更大、排列更致密的聚集体。
2.3 利用N-氧化物诱导聚集的探针表征以检测血红素：基于上述发现的“聚集-溶解”转变策略，研究者评估了初始探针FBO和FNO对血红素的响应。它们以“淬灭”模式响应血红素，背景信号较高。机制研究表明，血红素催化还原了探针的N-氧化物基团，生成了脱氧产物，从而改变了聚集状态和荧光。
2.4 基于N-氧化物诱导聚集的理性设计：从“淬灭”探针到“点亮”探针：为了获得高信噪比的探针，研究者理性设计并合成了吗啉N-氧化物探针FMO。FMO在水中溶解性好、背景荧光极低。当与血红素反应被还原为FM后，FM由于溶解度降低而发生聚集，产生强烈的聚集诱导发光，实现了超过10倍的荧光增强。FMO对血红素和血红蛋白均显示出高选择性和灵敏度，检测范围可达微摩尔级别，检测限低至2.64 nM，并且对pH值（4-9）具有良好的耐受性。
2.5 应用：利用新型探针FMO检测溶血：在苯肼诱导的溶血小鼠模型中，研究者用优化后的条件（500倍稀释血浆）成功检测了小鼠血浆中的总血红素水平。结果显示，溶血小鼠的血浆血红素浓度（35 μM）显著高于对照组（4.8 μM），成功区分了溶血状态。而商业化吸光度试剂盒的检测结果则因受血浆中其他物质（如胆红素）干扰而数值偏高，表明FMO探针的方法可能更灵敏、更特异地反映真实溶血情况。
综上所述，这项研究系统地揭示并证明了N-氧化物存在一种此前被忽视的、结构依赖性的聚集行为。这一基础发现打破了N-氧化物仅具增溶作用的传统认知。更重要的是，研究者将这一新理解转化为一种创新的检测策略，并成功开发出新型AIE探针FMO。FMO能够以“点亮”模式，高特异性、高灵敏度、宽范围地检测血红素，并在小鼠溶血模型中展现出优异的诊断潜力。这项工作的意义不仅在于提供了一个性能优异的血红素检测工具，更重要的是，它开辟了利用N-氧化物结构依赖性物理性质（聚集/溶解）来设计功能性生物传感器和生物材料的新思路。鉴于N-氧化物本身是常见的代谢产物和药物结构单元，其在生物体内的潜在聚集行为及其对药物药代动力学、细胞稳态的可能影响，也为未来的生物医学研究提供了一个值得关注的新视角。这项研究是基础科学发现驱动应用创新的一个典范，有望推动N-氧化物在生物医学和材料科学领域更广泛、更深入的应用。
