抑制N端乙酰转移酶C可缓解癌症恶病质中内质网应激介导的肌肉萎缩

《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Inhibition of N-Terminal Acetyltransferase C Mitigates Endoplasmic Reticulum Stress–Mediated Muscle Atrophy in Cancer Cachexia

癌症恶病质导致肌肉萎缩的机制不清。为探寻内质网应激(ER stress)在其中的作用，研究人员通过全基因组CRISPR筛选，发现N端乙酰转移酶C(NatC)是ER应激的关键耐受因子，并通过ATF6通路被上调。抑制NatC可通过下调组织蛋白酶K(CTSK)稳定胰岛素受体底物1(IRS1)，从而恢复Akt/mTOR合成代谢通路，在体内外模型中有效缓解肌肉萎缩。这提示NatC是治疗癌症恶病质肌肉消耗的潜在新靶点。

　　

癌症，一个让人闻之色变的词语，其危害不仅在于肿瘤本身，还常常伴随一种被称为“恶病质”的严重并发症。癌症恶病质是一种复杂的综合征，以进行性的体重减轻和肌肉消耗为特征，极大地损害了患者的生活质量和生存率。患者会变得极度消瘦、虚弱，这不仅让化疗、手术等治疗更加难以耐受，也直接加剧了病情。据统计，在发达国家，近50%-80%的癌症患者深受其害。长期以来，科学家们知道恶病质与身体内蛋白质合成减少、分解代谢增强有关，但驱动这种异常“燃烧”肌肉的根本机制，仍然笼罩在迷雾之中。近年来，一种名为“内质网应激”的细胞压力现象，及其引发的“未折叠蛋白反应”，在癌症恶病质患者的肌肉样本和动物模型中被观察到，提示它可能是连接癌症与肌肉萎缩的关键桥梁。内质网是细胞内的“蛋白质加工厂”，负责新合成蛋白质的正确折叠。当压力过大导致错误折叠的蛋白质堆积时，就会触发未折叠蛋白反应来尝试修复。然而，慢性的、过度的内质网应激不仅无法恢复平衡，反而会激活一系列导致细胞损伤、炎症乃至凋亡的信号通路，最终可能“误伤”肌肉。那么，在内质网应激这条通往肌肉萎缩的道路上，是否存在关键的“路标”或“开关”，能够被我们识别并关闭，从而阻止肌肉的流失呢？为了回答这个关键问题，并探寻对抗癌症恶病质的新策略，来自日本京都府立医科大学等机构的研究团队进行了一项深入探索。他们的研究发表于《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》杂志，题目为“抑制N端乙酰转移酶C可缓解癌症恶病质中内质网应激介导的肌肉萎缩”。

研究者们为了系统性地解答上述问题，综合运用了多种前沿的细胞与分子生物学技术。首先，他们利用路易斯肺癌(LLC)细胞皮下移植，在小鼠体内成功构建了癌症恶病质模型，并通过胫骨前肌(TA)质量、握力、悬吊时间等指标评估肌肉萎缩程度。其次，他们采用了C2C12小鼠成肌细胞分化的肌管作为体外模型，用LLC细胞的条件培养基或药物（如衣霉素）诱导内质网应激和萎缩。最关键的技术突破在于，研究者对C2C12成肌细胞进行了全基因组CRISPR筛选，以寻找在衣霉素诱导的内质网应激下，能够抵抗细胞生长抑制的关键基因。筛选结果通过生物信息学分析（如MAGeCK算法、基因集富集分析GSEA）进行解读。在机制探索层面，他们使用了小干扰RNA(siRNA)在细胞中进行基因敲低，利用腺相关病毒(AAV9)载体在小鼠肌肉中递送短发夹RNA(shRNA)进行体内基因沉默。通过蛋白质印迹(Western blot)、实时定量PCR(qPCR)、免疫荧光等技术，系统检测了内质网应激标志物（如CHOP、Bip）、NatC组分（Naa35, Naa38, Naa30）、CTSK、IRS1以及Akt/mTOR通路关键蛋白（p-Akt, p-S6）的表达与磷酸化水平。此外，还采用了SUnSET assay评估蛋白质合成速率，通过游离酪氨酸释放实验评估蛋白质降解速率。

3.1 癌症恶病质诱导骨骼肌发生内质网应激

研究人员首先在体内模型中证实了癌症恶病质与内质网应激的关联。将LLC细胞移植到小鼠背部皮下4周后，虽然小鼠总体重未显著下降，但其胫骨前肌湿重明显减轻，肌肉纤维横截面积减小，并伴有脂肪变性。功能上，患癌小鼠的四肢握力和悬吊时间均显著下降。分子水平上，萎缩肌肉中内质网应激下游分子（Bip, Xbp1s, CHOP, ATF4, ATF6）以及肌肉萎缩相关的E3泛素连接酶（MuRF1, MAFbx1）的转录水平上调，而合成代谢相关的mTOR通路活性被显著抑制。这些结果表明，在癌症恶病质模型中，骨骼肌确实发生了内质网应激，并与肌肉萎缩和功能衰退同步出现。

3.2 长期内质网应激在体外重现肌管萎缩

在体外，用LLC细胞条件培养基或衣霉素处理分化好的C2C12肌管，均能诱导肌管直径变细，即模拟了萎缩表型。同时，内质网应激标志物和萎缩相关基因表达上调，Akt/mTOR通路被抑制。这说明LLC介导的恶病质表型可以在肌管中复现，并且内质网应激参与了这一过程。

3.3 全基因组CRISPR筛选鉴定出NatC是内质网应激耐受性调节因子

为深入理解内质网应激介导萎缩的机制，研究团队在C2C12成肌细胞中进行了全基因组CRISPR筛选，寻找在长期衣霉素处理下仍能维持细胞生长的基因。筛选及生物信息学分析将矛头指向了N端乙酰转移酶C(NatC)。NatC是一个由催化亚基Naa30和两个辅助亚基Naa35、Naa38组成的异源三聚体复合物，负责对N端为甲硫氨酸后接疏水性氨基酸（如M-L, M-F, M-I, M-W）的蛋白质进行N端乙酰化修饰。流式细胞术验证实验表明，敲除NatC的三个组分（Naa30, Naa35, Naa38）能保护细胞免受衣霉素诱导的生长抑制，而敲除其他NAT家族成员（如NatA, NatB等）则无此效果。同时，衣霉素处理会上调NatC组分的表达。这些发现表明，NatC被内质网应激上调，并参与了其对细胞生长的抑制作用。

3.4 沉默NatC可减轻内质网应激相关的肌管萎缩

在分化的肌管中，敲低Naa35能显著缓解由衣霉素或LLC条件培养基诱导的肌管萎缩，表现为肌管直径的维持和萎缩相关基因MuRF1、MAFbx1表达上调的减弱。在另一株结肠癌细胞C26的条件培养基诱导的萎缩模型中也观察到了类似效果。然而，在由地塞米松（一种不依赖于内质网应激的类固醇激素）诱导的肌管萎缩中，敲低Naa35并无保护作用。这证实了NatC的作用特异于内质网应激相关的肌肉萎缩途径。

3.5 ATF6在内质网应激下上调NatC表达

内质网应激通过三个主要传感器（PERK, IRE1α, ATF6）触发未折叠蛋白反应。研究人员使用特异性抑制剂发现，只有ATF6的抑制剂AEBSF能够阻断衣霉素引起的NatC组分（Naa35, Naa38, Naa30）表达上调。反之，使用ATF6激活剂AA147能以剂量依赖的方式诱导Naa35的表达。这表明，在内质网应激下，NatC的转录上调是由ATF6通路驱动的。

3.6 NatC通过稳定组织蛋白酶K(CTSK)并经由IRS1-Akt/mTOR通路诱导萎缩

接下来，研究探索了NatC下游的具体作用机制。他们发现，敲低Naa35会降低组织蛋白酶K(CTSK)的蛋白水平，但不影响其mRNA，提示NatC可能通过N端乙酰化修饰来稳定CTSK蛋白。CTSK是一种蛋白酶，其N端序列为甲硫氨酸-色氨酸(M-W)，正是NatC的潜在底物。之前的研究表明CTSK可以降解胰岛素受体底物1(IRS1)。本研究中，过表达CTSK确实减少了IRS1蛋白。进一步的机制链条被理清：在内质网应激下，由ATF6上调的NatC乙酰化并稳定了CTSK蛋白，CTSK随后降解IRS1，导致其下游的Akt/mTOR信号通路被抑制。Akt/mTOR是调节蛋白质合成和细胞生长的核心通路，其抑制会导致蛋白质合成减少、降解增加，并上调MuRF1和MAFbx1等萎缩基因，最终引发肌肉萎缩。敲低Naa35则能逆转这一链条，恢复IRS1水平、Akt和S6的磷酸化，改善蛋白质合成与降解的平衡。

3.7 在小鼠癌症恶病质模型中沉默Naa35可预防骨骼肌萎缩

最后，研究在体内验证了靶向NatC的治疗潜力。在LLC荷瘤小鼠中，肌肉内注射携带靶向Naa35的shRNA的腺相关病毒(AAV9)。4周后，与注射对照病毒的小鼠相比，Naa35敲低组小鼠的胫骨前肌湿重和肌纤维横截面积得到显著保留，肌肉萎缩和脂肪变性减轻。在功能上，这些小鼠的四肢握力和悬吊时间也明显改善。分子机制上，肌肉中CTSK蛋白表达降低，而Akt和S6的磷酸化水平得以恢复。重要的是，这种治疗并未影响小鼠的体重和肿瘤体积，表明其作用直接针对肌肉萎缩本身。

本研究通过创新的全基因组CRISPR筛选，首次将N端乙酰转移酶C(NatC)确立为癌症恶病质中内质网应激介导肌肉萎缩的关键决定因子。研究揭示了一条清晰的致病通路：在癌症环境下，肿瘤分泌的因子（可能包括炎症因子、活性氧等）诱导骨骼肌发生内质网应激；内质网应激通过激活其传感器ATF6，上调NatC的表达；NatC进而通过N端乙酰化修饰稳定组织蛋白酶K(CTSK)蛋白；增加的CTSK降解胰岛素受体底物1(IRS1)，从而抑制了至关重要的合成代谢通路——Akt/mTOR信号，最终导致蛋白质合成减少、分解增加，引发肌肉萎缩和功能丧失。

这项研究的意义重大。首先，它从全新的角度——蛋白质翻译后修饰（N端乙酰化）——阐明了癌症恶病质肌肉消耗的分子机制，将内质网应激、蛋白质稳态与合成代谢通路紧密连接起来。其次，研究不仅停留在机制阐释，更通过体内实验证明，局部肌肉内敲低NatC的核心组分Naa35，就能有效缓解荷瘤小鼠的肌肉萎缩和功能衰退，且不影响肿瘤本身，这为治疗提供了高度的靶向性和安全性预期。因此，NatC复合物，尤其是其组分Naa35，成为一个极具潜力的新型治疗靶点。针对该靶点开发小分子抑制剂或基因治疗策略，有望为目前缺乏有效疗法的癌症恶病质患者，提供一种阻止或逆转肌肉流失、改善生活质量和治疗耐受性的新途径。当然，研究也存在一些局限，例如尚未直接证明NatC对CTSK的乙酰化修饰，上游具体的肿瘤分泌因子也有待鉴定，且需要更多癌种模型验证其普适性。未来的研究将围绕这些方面深入，推动这一发现向临床转化迈进。