《Materials Today Bio》：Thermoreversible Cell-Derived Extracellular Matrix Only hydrogel (CEOgel): Development, Characterization, and Applications
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为克服组织来源细胞外基质（tECM）来源受限、批次差异大、免疫风险高及难以定制等挑战，研究人员成功开发了一种完全由细胞源脱细胞外基质（cECM）制备的新型热可逆水凝胶（CEOgel）。该研究首次实现了仅由cECM组成的、具有温度敏感性的水凝胶的制备，无需依赖动物组织或外部交联剂。CEOgel展现出优异的生物相容性、可注射性，并能在微流控芯片中支持内皮细胞血管网络形成及结直肠癌类器官生长，为组织工程和再生医学提供了创新、可定制的生物材料平台。
在生物医学和再生医学领域，为细胞提供一个仿生的、支持其生长和功能的“家”至关重要，这个“家”就是细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）。天然ECM成分复杂，能提供结构和生化信号，是理想的组织工程支架和三维细胞培养基质材料。传统的做法是从动物或人尸检组织中提取ECM，经脱细胞处理后制成水凝胶，即组织来源的ECM水凝胶（tECMgel）。然而，这种方法面临捐赠组织来源有限、批次间差异大、存在免疫排斥和疾病传播风险，且其成分固定难以根据特定需求进行定制。
与此同时，细胞来源的ECM（cell-derived ECM, cECM）作为一种有前途的替代方案出现了。cECM在体外由特定类型的细胞分泌产生，更容易获取，批次差异小，免疫原性低，并且理论上可以通过选择不同的细胞来源来定制其成分。但一个长期存在的挑战是，如何将cECM制成一种能响应生理温度、可注射、并能可逆进行溶胶-凝胶转变的水凝胶，而无需添加外部的聚合物或化学交联剂。此前，大部分cECM仅能作为二维涂层或需与其他材料（如胶原蛋白、海藻酸盐）混合才能形成凝胶，这无疑稀释了其作为细胞特异性微环境的独特优势。
为此，由Byoungha An、Jae Won Kwon、Heejeong Yoon、Tae-Eun Park、Seung Won Yang和Kwideok Park组成的研究团队，在《Materials Today Bio》上发表了一项突破性研究。他们成功开发了一种全新的、完全由cECM制备的热可逆水凝胶，并将其命名为“细胞来源的只含水凝胶”（CEOgel）。这项研究不仅提供了一种创新的水凝胶制造方法，还通过详尽的表征和应用测试，证明了CEOgel在基础研究和临床转化方面的巨大潜力。
为开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们建立了一套优化的CEOgel制备流程，包括对体外培养的脐带间充质干细胞（UCMSC）进行脱细胞处理，随后对获得的cECM进行酶消化、中和、冻干，再经重悬、超声处理和低温孵育，最终得到浓缩的cECM纳米纤维（cENF）溶液，该溶液可在37°C下凝胶化。其次，他们利用多种生物物理和生化技术对CEOgel进行了全面表征，如动态光散射（DLS）分析纤维尺寸、浊度法监测凝胶动力学、流变学测试机械性能、扫描电镜（SEM）观察微观结构，以及蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光和蛋白质组学（质谱）分析其分子组成。此外，研究还通过体外细胞活力与增殖实验、免疫原性评估（巨噬细胞共培养）、3D内皮细胞血管形成实验、结直肠癌类器官培养模型，以及小鼠皮下植入实验，系统评估了CEOgel的生物相容性和功能应用。样本来源方面，CEOgel主要来源于健康人脐带间充质干细胞（UCMSC），并验证了从皮肤成纤维细胞和基因工程细胞（COL1A1过表达的HEK293T细胞）来源cECM制备的可行性。
2.1. CEOgel的制备及其凝胶机制
研究人员开发了一套新颖的制备策略，核心在于增强cECM的溶解度和将纤维纳米化。具体包括在酶消化后将溶液中和（显著提高透光率），以及通过超声和4°C孵育将cECM纤维尺寸减小至纳米级别，从而制备出高浓度、均一的cENF溶液。该溶液在37°C可发生溶胶-凝胶转变形成CEOgel，并表现出热可逆性（可在升温凝胶和降温溶胶间多次转换，尽管强度会逐渐减弱）。凝胶动力学分析表明，其凝胶化速度快于多数报道的tECM水凝胶。通过分子解离实验发现，氢键是CEOgel网络形成的主要作用力，疏水相互作用次之，而二硫键贡献甚微。SDS-PAGE分析显示CEOgel含有从<25 kDa到>300 kDa的广泛分子量范围的蛋白质。
2.2. CEOgel的表征
生化分析显示，脱细胞过程去除了约99.3%的DNA，残留DNA含量低于公认的免疫原性阈值。CEOgel含有总蛋白和糖胺聚糖（GAG），并保留了多种生物活性生长因子，其中与血管生成相关的因子（如PDGFA、VEGFD等）含量较高。免疫荧光证实了胶原蛋白I型、纤连蛋白和层粘连蛋白在凝胶中均匀分布。扫描电镜显示CEOgel具有由交织纳米纤维构成的多孔结构，且浓度越高，网络越致密。流变学测试表明CEOgel具有凝胶特性（储能模量G‘ > 损耗模量G“），其刚度可通过浓度调节，在67 mg/mL时与Matrigel相当。体外酶降解实验表明CEOgel可被胶原酶/分散酶降解。此外，CEOgel具有一定透光性，适合光学显微镜观察。研究还探索了通过过渡金属络合（K2Pt(II)Cl4）进一步增强其刚度和透明度的可能性。
2.3. CEOgel的蛋白质组学分析
对UCMSC来源cECM的蛋白质组学分析鉴定出超过3400种蛋白质，其中包含多达203种基质组（Matrisome）蛋白质。分析表明，不同供体或不同批次的cECM其基质组蛋白谱高度相似，显示出低变异性和高可重复性。基因本体（GO）分析显示，基质组蛋白显著富集于ECM组织、血管发育等相关生物学过程。值得注意的是，将CEOgel中高丰度的蛋白质与多种人体组织的蛋白质组数据进行比对，发现其蛋白谱与广泛的人体组织具有高度相似性，表明CEOgel蕴含了跨组织普遍表达的蛋白质，支持其广泛的应用潜力。
2.4. 通过基因工程定制CEOgel成分
为了展示cECM在成分定制方面的优势，研究人员通过基因工程过表达了HEK293T细胞中的COL1A1（胶原蛋白I型）基因。成功建立了稳定过表达COL1A1的细胞系，并从中提取cECM制备了CEOgel。Western blot证实工程化细胞来源的cECM中COL1A1蛋白显著富集，且由此制备的CEOgel同样能形成稳定的凝胶。这证明了通过对ECM分泌细胞进行遗传改造，可以主动调节CEOgel的生化组成，这是传统的组织来源或动物来源ECM水凝胶难以实现的。
2.5. CEOgel的体外生物相容性及应用
细胞毒性实验表明，多种细胞（内皮细胞HUVEC、间充质干细胞UCMSC、皮肤成纤维细胞BJ）在CEOgel涂层上培养、封装于其中或与其非接触共培养时，均保持高活力并能持续增殖。与巨噬细胞共培养实验显示，CEOgel不会诱导炎症因子TNF-α的显著释放，表明其免疫原性低。在功能应用上，封装在CEOgel中的HUVEC能够形成毛细血管样网络结构，并且该网络在静态3D培养和微流控芯片动态培养体系中均能形成并维持。此外，CEOgel能成功支持结直肠癌（CRC）类器官的存活、增殖和发育，类器官表达上皮连接标记物E-钙粘蛋白和增殖标记物Ki-67，展现出与在Matrigel中培养相似的极性结构。
2.6. CEOgel的体内生物安全性评估
CEOgel展现出良好的可注射性，其cENF溶胶可通过26G甚至32G针头顺利注射，并在37°C皮下环境中原位形成凝胶。小鼠皮下植入实验表明，注射部位无异常炎症反应。植入的CEOgel随时间推移被宿主细胞浸润并逐渐降解，基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达与降解过程相关。早期有免疫细胞（如巨噬细胞）浸润和轻度炎症反应，但随后炎症消退，未形成纤维包裹，且在第30天时血清炎症因子（TNF-α, IL-6）水平与对照组无差异。重要的是，在植入后期（第20天），在CEOgel内部观察到了由CD31+内皮细胞和PDGFRβ+壁细胞覆盖的成熟血管结构，表明发生了积极的血管生成和组织整合。对主要器官的组织学检查未发现异常，证实了其全身安全性。
综上所述，本研究成功地建立了一种制备完全由细胞来源、脱细胞外基质构成的热可逆水凝胶（CEOgel）的新方法。该平台无需动物组织或外源性交联剂，仅通过优化cECM的溶解和纳米化处理即可实现。研究结论强调，CEOgel不仅具有良好的生物相容性、可注射性、可降解性和可调节的机械性能，其蛋白质组学特征还显示出低批次变异性和与多种人体组织的广泛相似性。更为重要的是，通过遗传改造ECM分泌细胞，可以实现对CEOgel生化组成的主动定制，这突破了传统天然聚合物水凝胶在可调性方面的局限。
这项研究的意义重大。首先，CEOgel填补了纯粹cECM来源的热可逆水凝胶领域的空白，将cECM的生物学精确性与相变水凝胶的 versatility 相结合，极大地扩展了cECM材料的应用范围。其次，它提供了一个高度可定制化的平台，可用于构建细胞类型特异性的3D培养微环境，在组织工程、疾病建模（如癌症研究、类器官培养）、药物筛选和再生医学中具有广阔前景。最后，其易于在实验室台面制备的特性，使得根据特定研究需求“量身定制”细胞培养基质成为可能，推动了下一代脱细胞ECM水凝胶的概念和技术发展。
