将源自芽孢杆菌的蛋白酶固定到羧甲基壳聚糖气凝胶上：一种用于细菌灭活、皮肤癌治疗和加速伤口愈合的生物活性平台

《Microbial Pathogenesis》：Immobilization of Bacillus-Derived Protease onto Carboxymethyl Chitosan Aerogel: A bioactive platform for bacterial inactivation, skin cancer therapy, and accelerated wound healing

开发多功能创伤护理材料，整合抗菌、促愈合和抗癌功能，本研究通过固定Bacillus蛋白酶于羧甲基壳聚糖气凝胶构建PR-CMCsAE复合物。PR0.3-CMCsAE展现出90±3.7%的高固定效率，72.5±1.91%的酶活性保留，对多种皮肤致病菌具有广谱杀菌效果（400 μg/mL完全灭活），抑制生物膜形成达7天，诱导A431癌细胞凋亡（存活率21.6%），促进体外伤口愈合（54.6% scratch closure）。其高孔隙率（>99.8%）和生物相容性（EC50>100）为新型创伤敷料开发提供理论依据。

　　

海亚姆·A·阿尔瓦比（Hayam A. Alwabsi）| 莫迪·阿尔巴拉维（Mody Albalawi）

沙特阿拉伯塔布克大学（University of Tabuk）理学院生物化学系，塔布克71491

摘要

开发能够应对细菌感染、促进组织再生并提供局部抗癌治疗的多功能伤口护理材料是当前生物医学领域的一个重要研究方向。在本研究中，我们通过将一种源自芽孢杆菌（Bacillus）的蛋白酶固定在羧甲基壳聚糖气凝胶（CMCsAE）上，制备了一种新型治疗支架（PR-CMCsAE），并评估了其抗菌、抗生物膜、抗癌及促进伤口愈合的特性。我们测试了两种不同的酶加载浓度（0.15克和0.3克），结果显示PR0.3-CMCsAE具有更高的固定效率（90 ± 3.7%）和更强的酶活性（72.5 ± 1.91%）。与游离酶相比，固定后的蛋白酶在热稳定性和pH稳定性方面表现更优，重复使用次数达到6次后仍保持75%的活性；长期储存后（4周）活性仍可保持在79.7%。PR0.3-CMCsAE对多种引起皮肤感染的细菌具有广谱杀菌效果，在400 μg/mL浓度下60–90分钟内即可完全杀灭细菌，并在7天内显著抑制生物膜的形成。针对A431皮肤癌细胞的抗癌实验表明，该材料能剂量依赖性地降低细胞存活率（最低降至21.6%），其主要死亡方式为细胞凋亡，这一结果得到了流式细胞术和AO/EB荧光成像技术的验证。此外，PR0.3-CMCsAE在体外实验中促进了伤口愈合，使伤口闭合程度提高了54.6%，而对照组仅为41.5%。毒性测试确认了该材料的生物相容性（EC50 > 100）。总体而言，PR-CMCsAE是一种集酶促清创、抗菌防御、抗癌活性和再生支持于一体的治疗平台，具有广泛应用于先进伤口敷料和局部皮肤癌治疗的巨大潜力。

引言

皮肤作为人体表面积最大的器官，在保护内部组织免受环境侵害（如微生物感染、紫外线辐射、机械损伤和极端温度）方面起着关键作用[1]。由于创伤、手术、烧伤或切割等原因导致的皮肤损伤会破坏表皮屏障，引发炎症反应，通常伴随疼痛、肿胀和功能受损[2]。受伤后，身体会启动复杂的伤口修复过程，这一过程涉及多种组织和分子层面的机制，并受到细胞因子和生长因子的调节[3][4]。糖尿病或高龄会干扰伤口愈合过程，导致慢性不愈合伤口的形成[5][6]。伤口愈合过程包括止血、炎症、增殖和重塑等多个相互叠加的阶段[7]。

伤口的细菌感染是一个重要的临床问题，会严重影响患者的治疗效果并增加医疗负担。目前，抗菌水凝胶因其能维持湿润的保护环境并具有局部抗菌作用而备受关注[8]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等机会性病原体常在开放性伤口上定植，导致反复感染和愈合延迟[9]。鉴于皮肤病变中细菌感染的日益普遍，人们越来越重视开发能够主动对抗微生物污染的先进抗菌绷带[10][11]。最近的研究成果催生了多种功能性生物材料，包括泡沫、薄膜、纳米纤维支架和基于水凝胶的系统，这些材料特别针对病变部位进行了优化设计[12][13][14]。一种非常有效的治疗方法是通过酶促方式去除细菌生物膜，这种生物膜由细菌自身产生的胞外聚合物（EPS）构成。破坏EPS结构会削弱生物膜的完整性，使细菌更容易受到人类干预和抗菌剂的作用[15]。

值得注意的是，能够影响EPS成分及其稳定性的酶包括蛋白酶、糖苷水解酶和DNA酶[16]。蛋白酶因其多种治疗优势而受到广泛关注：它们可通过酶促降解坏死组织、炎症介质和有毒副产物来促进伤口清创[17][18]。蛋白酶（也称为蛋白水解酶）能够水解肽键，将完整蛋白质分解为较短肽段和单个氨基酸。这些酶由动物、植物和微生物等生物系统产生，在许多生理和工业过程中发挥着重要作用[19]。特别是，蛋白酶能够降解细胞外基质成分、破坏生物膜结构并调节免疫反应，使其在伤口愈合、抗菌和抗癌应用中表现出优异性能[20]。与动物和植物来源的酶相比，微生物蛋白酶在生产效率、成本效益和环境可持续性方面更具优势[21]。蛋白酶（PR）是一类具有不同底物特异性和催化特性的酶，通常根据其切割模式和最佳pH条件进行分类[22]。

来自芽孢杆菌属（Bacillus）的微生物蛋白酶在生物医学应用中展现出巨大潜力，例如它们能够杀死细菌并降解生物膜中的蛋白质，从而增强抗菌效果并促进伤口愈合[23]。然而，由于其稳定性较差、容易被蛋白酶降解以及在伤口部位难以维持有效浓度，其临床应用受到限制[24]。为了解决这些问题，人们将蛋白酶固定在固体载体上以提高其稳定性、减少自溶并延长其活性时间[25]。虽然固定过程可以提高热稳定性和操作稳定性，但也可能影响催化活性和底物的可及性[26]。最近开发的纳米结构载体在恶劣条件下提升了酶的性能，这证明了使用多孔壳聚糖气凝胶作为固定基质的有效性[27]。

羧甲基壳聚糖（CMCs）作为一种水溶性壳聚糖衍生物，具有多种有利特性，如丰富的化学调控功能基团以及自身的抗菌性和水凝胶/气凝胶结构[28][29]。因此，CMCs成为治疗递送系统中生物活性载体的理想选择[30]。当制成气凝胶形式时，CMCs能够形成轻质、高孔隙率的支架，内部表面积可达99.8%以上[31]。这种气凝胶结构有利于酶的固定，因为它具有较高的载药量、卫生的微环境以及良好的气体交换和控释能力，这些都是先进伤口护理所必需的[32]。为了在固定过程中保持蛋白质结构和催化效率，通常采用特定的气凝胶结构。然而，孔径分布对固定蛋白酶的性能至关重要[33]。只有固定在气凝胶内部或表面的酶分子才能在处理大分子底物（如细胞外基质蛋白）时发挥催化作用[34]。

本研究的目的是将一种源自芽孢杆菌的蛋白酶固定在羧甲基壳聚糖气凝胶（CMCsAE）上，以构建一种生物活性支架。固定蛋白酶的目的是提高其稳定性，保持其生物活性，从而增强抗菌和抗生物膜效果，并促进伤口愈合。我们评估了这种固定蛋白酶的气凝胶（PR-CMCsAE）在抑制微生物生长、破坏生物膜、促进成纤维细胞迁移以及对抗皮肤癌细胞方面的效果。

试剂和化学品

本研究中使用的细菌蛋白酶粉末（300 ppm）来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），由Sigma-Aldrich（英国）提供。该酶为固体粉末，具有特征性的芳香气味，其比活性为95 UHb g?1（1 UHb单位指在标准实验条件下每分钟从血红蛋白中释放1 mmol酪氨酸所需的酶量）。羧甲基壳聚糖（CMCs）和戊二醛（25% H?O溶液）同样来自Sigma-Aldrich（美国）。

结果与讨论

蛋白酶的固定可以通过化学方法实现，例如交联或共价结合；也可以通过物理方法实现，如嵌入、包封或吸附到载体基质中[9]。固定蛋白酶可以提高生物催化剂的回收率、扩大反应器的设计范围，并降低运营成本[10]。在本研究中，我们使用了CMCsAE作为载体。

结论

本研究成功开发了一种多功能治疗平台，通过将源自细菌的蛋白酶固定在羧甲基壳聚糖气凝胶（PR-CMCsAE）上实现了这一目标。优化后的配方（PR0.3-CMCsAE）表现出优异的酶加载效率、更高的热稳定性和pH稳定性、良好的重复使用性以及较长的储存寿命。固定后的系统保持了较强的蛋白水解活性，有效促进了生物膜的酶促降解。

作者贡献声明

莫迪·阿尔巴拉维（Mody Albalawi）：负责撰写、审稿和编辑；原始草稿的撰写；数据整理；概念构思。 海亚姆·阿尔瓦比（Hayam Albalawi）：负责撰写、审稿和编辑；原始草稿的撰写；数据整理；概念构思

利益冲突

作者声明不存在任何利益冲突。

数据与材料的可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。