《Microchemical Journal》：Metrological traceability for monkeypox virus analysis: development of an inter-laboratory validated digital PCR reference measurement procedure
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猴痘病毒检测方法研究：建立数字PCR参考测量程序及实验室验证，证实其宽动态范围（22-23802 copies/reaction）、高灵敏度（22 copies/reaction）、优异重复性（CV≤10%）和稳定性，支持全球疫情监测与防控。
王霞|陈川|李慧杰|郭若辉|杨毅|牛春燕|周书军|高华芳|金小花|王尚军|杜美红|程晓燕|朱玲香|董连华
国家计量院先进测量科学中心，北京 100029，中国
摘要
准确检测和定量猴痘病毒（MPXV）对于有效的病毒诊断和流行病控制至关重要。然而，目前缺乏用于MPXV定量的高阶参考方法和参考物质（RMs），这阻碍了不同检测平台之间的一致性质量控制。在之前关于MPXV变异株（F3L基因）的研究基础上，本研究建立了一种针对野生型MPXV B6R基因的新参考测量程序（RMP），并对这两种目标进行了全面的实验室间验证。该方法表现出优异的性能：动态范围广（22–23,802拷贝/反应）、线性度高（R2 = 0.9985）以及定量限低（22拷贝/反应，CV ≤ 25%）。重复性测试显示，在使用不同dPCR平台的九个不同实验室中，实验室间的CV值始终低于10%。B6R和F3L基因的参考物质的回收效率约为69%，这一数据已被纳入不确定性预算中。均匀性评估显示一致性良好（CV = 2.94%），稳定性研究证实样品在-70°C以及4°C/-20°C短期储存条件下的稳定性。通过Mandel统计分析和类内相关系数（ICC）评估了野生型和变异型参考物质的高实验室间重现性。这种经过验证的dPCR RMP提供了计量学可追溯性，为MPXV诊断提供了可靠且可比较的结果，支持了全球范围内的公共卫生工作。
引言
猴痘病毒（MPXV）是一种属于痘病毒科（Poxviridae）正痘病毒属（Orthopoxvirus）的动物源性病毒。该病毒于1958年首次在实验室猴子中被发现[1]，随后在1970年的刚果民主共和国的人类中被检测到[2][3]。从2022年到2025年11月30日，全球共报告了175,415例实验室确诊病例和467例死亡病例。从结构上看，MPXV是一种双链DNA病毒，呈砖形或卵圆形，直径约为200–250纳米。其基因组长度约为197 kb，编码约190种蛋白质[4]。与其他正痘病毒类似，MPXV在基因上较为稳定，但可分为两个主要分支：中非分支（刚果盆地分支）和西非分支，其中中非分支的致病性更强[5]。传播主要通过动物源性的溢出事件发生，人际传播较为有限。自2022年5月以来，多个国家在非流行地区报告了猴痘病例，表明该病毒可能已经发生了流行病学变化[6]。感染后的潜伏期通常为6–13天（最长可达21天），临床表现包括淋巴结肿大和从面部向四肢扩散的离心性皮疹[7]。猴痘是一种严重的动物源性传染病，对人类健康和公共卫生安全构成重大威胁。因此，其检测、诊断以及疫情的预防和控制尤为重要。
有多种方法可用于检测猴痘病毒。传统方法包括使用特异性单克隆抗体的免疫荧光测定[8]和基于特定肽段的血清抗体ELISA[9]。然而，这些方法存在一些局限性，如操作繁琐、诊断时间较长、对采样环境要求严格以及容易受到样本污染的影响，从而影响实验结果。实时PCR[10]和测序等分子技术提供了替代方案，但定量PCR（qPCR）仍受扩增效率的限制，并且需要依赖外部标准进行相对定量。相比之下，数字PCR（dPCR）能够实现绝对核酸定量，无需校准曲线即可直接测量拷贝数[11][12][13][14]。尽管取得了这些进展，但目前仍缺乏用于MPXV定量的高阶参考方法和假病毒参考物质（RMs）以确保检测准确性。在我们之前的研究中[15]，我们建立了一种高精度的dPCR方法来检测MPXV F3L基因的变异株，并用它来表征F3L检测的参考物质。然而，这种dPCR方法的实验室间性能尚未得到评估。
在这项研究中，我们的目标是1）建立一种基于dPCR的参考测量程序（RMP），用于表征MPXV野生型B6R基因的参考物质；2）使用建立的参考物质评估这两种提出的RMPs在MPXV F3L和B6R检测中的实验室间性能。
参考物质制备
参考物质的制备
假病毒是通过在体外合成猴痘病毒B6R基因序列（基因ID：928902）制备的。然后将该序列克隆到Ad5复制缺陷腺病毒载体中，并在293A细胞中制备成假病毒[15]。所得到的假病毒由包裹在腺病毒衣壳内的DNA序列组成，通过色谱柱纯化后，用保病毒溶液稀释至目标浓度，并分装至110 μL容量管中。
dPCR优化
如图1所示，在所有五个测试的退火温度下均获得了可接受的扩增效果。优化采用了一次一个变量的方法（OVAT）在有限的实验范围内进行。然而，我们的目的不是确定该检测方法的全球最佳数学参数，而是获得稳定的扩增效果以及负滴和正滴群体之间的清晰分离。考虑到滴分离和扩增的重复性
结论
准确检测猴痘病毒对于诊断、预防和流行病控制至关重要，因此有必要开发准确的参考方法和参考物质（RMs）。我们建立了一种基于绝对定量dPCR方法的B6R基因定量参考测量程序（RMP）。我们的结果表明，所提出的dPCR RMP具有高准确性和分析灵敏度，是一种可靠的猴痘病毒检测参考方法。
CRediT作者贡献声明
王霞：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草案、验证、方法学、数据分析、数据管理。
陈川：监督。
李慧杰：验证、方法学、数据分析。
郭若辉：方法学。
杨毅：验证、方法学、数据分析。
牛春燕：验证、监督。
周书军：验证。
高华芳：验证。
金小花：验证。
王尚军：验证。
杜美红：验证。
程晓燕：验证。
朱玲香：验证。
资助
本工作得到了国家计量院基础科学研究项目的支持（AKYZD2202）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢Turtle Technology Co., Ltd.、Qiagen Co., Ltd.和Sniper Medical Technology Co., Ltd.参与实验室间评估工作。
