Liproxstatin-1 通过抑制铁死亡（ferroptosis）引起的炎症，有助于急性脊髓损伤后的功能恢复

《Molecular and Cellular Neuroscience》：Liproxstatin-1 improves functional recovery after acute spinal cord injury by inhibiting ferroptosis-induced inflammation

脊髓损伤铁依赖性脂质过氧化引发细胞死亡及炎症反应，Liproxstatin-1通过抑制脂质过氧化和调节铁代谢改善神经功能。

　　

华中农业大学生命科学技术学院生物医学与健康学院湖北洪山实验室，中国武汉，430070

摘要

铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化介导的调控性细胞死亡形式，与急性脊髓损伤（ASCI）的继发阶段有关。然而，其在ASCI背景下的具体分子网络及其与炎症过程的相互作用仍不清楚。我们在大鼠T10挫伤模型中研究了铁死亡抑制剂Liproxstatin-1的作用。通过行为评估、组织学、转录组学和生化检测方法评估了损伤后的Liproxstatin-1治疗效果。ASCI引发了广泛的转录组变化，包括参与脂质过氧化、铁代谢和抗氧化防御的铁死亡相关模块的表达改变。Liproxstatin-1改善了运动功能和平衡能力，减少了组织空洞形成、神经元丢失和胶质增生。转录组分析表明，Liproxstatin-1调节了与炎症、免疫细胞迁移和Toll样受体/NLRP3信号通路相关的基因。在HT22细胞中，Liproxstatin-1抑制了Erasstin诱导的铁死亡，降低了ROS水平，恢复了谷胱甘肽，减少了脂质过氧化，并下调了HMGB1、TLR4、TNF-α和NLRP3的表达。在体内实验中，Liproxstatin-1减少了铁沉积，恢复了谷胱甘肽，减轻了脂质过氧化，逆转了GPX4的表达下调，并抑制了炎症蛋白的升高。这些发现表明，Liproxstatin-1通过同时抑制铁死亡及其相关的炎症激活来提供神经保护，从而突显了铁死亡作为潜在治疗靶点的作用。

引言

急性脊髓损伤（ASCI）会导致严重的、通常是永久性的残疾，在其继发损伤阶段有效的治疗方法有限（Hellenbrand等人，2021；McEwen等人，2011）。初始创伤后，一系列继发事件——包括血脑屏障破坏、炎症、氧化应激和细胞死亡——导致神经元逐渐丢失、轴突退化和组织破坏，从而严重限制了康复（Grimm等人，2014；Kawano等人，2019；Tavangar等人，2007）。目前的干预措施仅能部分缓解症状，无法阻止继发性损伤的进展（Kawano等人，2019），这突显了针对特定病理机制的策略的必要性。 继发性损伤涉及氧化应激、炎症和细胞死亡等相互关联的过程（Ryan等人，2024；Wu等人，2025）。损伤后的出血和免疫细胞浸润会破坏铁稳态，导致损伤区域铁积累（Kafura等人，2025；Ryan等人，2024）。在富含脂质的中枢神经系统中，过量的铁会促进脂质过氧化和氧化损伤（Fan等人，2025；Yang等人，2023）。铁死亡是一种依赖铁、由脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡形式，已被认为与脊髓损伤病理有关（Ryan等人，2024）。ASCI从急性到慢性阶段都会增加铁死亡标志物的表达，包括铁沉积、谷胱甘肽耗竭和脂质过氧化加剧（Fan等人，2025）。铁死亡还会放大局部炎症和组织破坏，促进继发性损伤的进展（Zhao等人，2025；Zhao等人，2024），因此它成为连接氧化应激、炎症和神经退化的枢纽（Kafura等人，2025；Wu等人，2024）。 除了导致细胞死亡外，铁死亡还可能在ASCI中引发炎症。铁死亡产生的活性氧、脂质过氧化产物和损伤相关的分子模式可以激活Toll样受体4（TLR4），从而触发MyD88依赖的信号通路和NLRP3炎性小体的组装。这种TLR4–NLRP3轴促进caspase-1的激活和IL-1β及IL-18的释放，加剧神经元损伤和胶质增生。反过来，炎症会加剧氧化应激和线粒体功能障碍，可能形成一个正反馈循环，放大铁死亡和炎症损伤，从而阻碍康复。 Liproxstatin-1是一种表征良好的铁死亡抑制剂，可阻断脂质过氧化并维持氧化还原稳态（Fu等人，2025）。它在神经损伤和退化模型中减少了脂质过氧化、铁积累和细胞死亡（Li等人，2024a；Lin等人，2025），并可以减弱相关的炎症反应（Deng等人，2023；Zhong等人，2024）。然而，尽管有证据表明铁死亡与ASCI有关，但Liproxstatin-1在此背景下的治疗潜力及其与TLR4–NLRP3轴等炎症途径的可能相互作用仍不明确（Liu等人，2025；Zhou等人，2025）。 因此，本研究旨在探讨铁死亡在ASCI中的作用，并评估Liproxstatin-1的效果。我们使用大鼠ASCI模型，通过行为、组织和生化检测来确定Liproxstatin-1对铁稳态、脂质过氧化和炎症的影响。进一步利用转录组分析和体外铁死亡模型来研究Liproxstatin-1是否调节铁死亡与TLR4–NLRP3炎症轴之间的相互作用。

动物和伦理声明

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验室动物护理和使用的指南，并获得了武汉大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：ZN2021119）。使用的是雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重250–300克，购自北京Vital River实验室动物技术有限公司）。大鼠被饲养在武汉大学中南医院的动物实验中心。

实验设计和分组

动物被随机分为三组：假手术组（Sham）、ASCI组以及接受Liproxstatin-1治疗的ASCI组（ASCI + Lip-1）。分组由未参与后续实验的操作员完成。所有行为评估和数据分析均由对分组情况不知情的研究人员完成。 各实验组的样本量如下：行为评估，每组6只大鼠，在术后第1天、第3天、第7天和第14天进行。

Basso–Beattie–Bresnahan（BBB）运动评分

在指定时间点，将大鼠置于开放场地中自由活动。如有必要，会给予轻微刺激以诱导行走。由两名不知情的观察者根据BBB评分系统（0–21分）独立评估后肢关节活动、躯干稳定性和协调性。统计分析使用两名观察者的平均得分。

倾斜平面测试

将大鼠放置在一个可调节的粗糙表面上。倾斜角度以每秒2°的速度增加。

组织和免疫组化分析

术后第15天，大鼠被深度麻醉并通过心灌注法用PBS冲洗，随后用4%的福尔马林（PFA）处理。灌注后立即采集T7–T12节段，其中心位于损伤部位，然后在4% PFA中固定24小时，进行石蜡包埋，并切成4微米厚的横截面。

铁死亡相关生化参数的测量

术后第15天，采集损伤区域的脊髓组织。根据商业试剂盒说明书测量以下参数。

Western blot分析

术后第15天，将损伤区域的脊髓组织用RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS）裂解，并加入Roche蛋白酶抑制剂混合物（04693132001）以提取总蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒定量总蛋白含量。等量的蛋白通过12% SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，并在4°C下与以下一级抗体一起孵育过夜：

RNA提取和质量控制

术后第15天，使用Tritizol试剂从损伤区域提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计评估RNA的纯度和浓度，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估其完整性。

文库构建和测序

使用TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（Illumina）制备测序文库，并在Illumina HiSeq X Ten平台上进行150 bp配对末端读长（PE150）的测序。文库构建和测序由OE Biotech有限公司完成。

数据解析

原始数据...

细胞培养

小鼠海马神经元细胞系HT22（Procell，CL-0697）在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的高葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在37°C、5% CO₂的潮湿培养箱中维持。

铁死亡诱导和干预

为了建立体外模型，HT22细胞用5 μM Erastin（Selleck，S7242）处理24小时以诱导铁死亡。为了评估Liproxstatin-1的效果，细胞预先用0.5 μM Liproxstatin-1处理

定量实时PCR（qRT-PCR）分析

术后第15天，使用Tritizol试剂从损伤区域提取总RNA并逆转录为cDNA。使用Applied Biosystems公司的7500 Real-Time PCR系统，通过SYBR Green方法定量目标基因（Nlrp3、Tlr4、Tnf、Cybb、Lcn2和Nfe2l2）的mRNA表达。PCR反应混合物包含10 μL SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，4309155）、1 μL cDNA模板、0.5 μM每种引物和8 μL无核酸酶...

统计分析

数据以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism软件（版本10.2.3）进行统计分析。两组之间的比较使用双尾Student's t-检验。当显示显著差异时，使用单因素方差分析（ANOVA）进行多组比较，随后进行Tukey的事后检验。行为数据（BBB评分和角度评分）使用双向重复测量ANOVA进行分析...

急性脊髓损伤后脊髓组织中的转录组变化和铁死亡相关基因表达谱

为了系统地分析ASCI后的转录组变化，对Sham组和ASCI组的脊髓组织进行了RNA测序。使用

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< 0.05和|log2倍数变化| > 0.585的阈值识别DEGs。与Sham组相比，ASCI组有4002个DEGs，包括2265个上调基因和1737个下调基因（图1A），表明ASCI后发生了广泛的转录组重塑。火山图显示了基于倍数的DEGs总体分布...

讨论

本研究结合了转录组学、行为学和分子生物学分析，以评估铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在ASCI中的作用。ASCI引发了广泛的铁死亡相关分子变化和炎症。Liproxstatin-1改变了铁死亡和炎症相关基因的表达，在体内改善了运动和组织学结果，并在体外抑制了关键的铁死亡和炎症相关标志物。这些发现表明Liproxstatin-1具有... < /> 潘雷：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、正式分析。江涛宇：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化。郝莉玛：撰写——审阅与编辑、正式分析、数据管理、概念化。范瑶：验证、项目管理、概念化。金晓青：撰写——审阅与编辑、数据管理、概念化。 伦理批准和参与同意 所有动物实验程序均获得了武汉大学机构动物护理和使用委员会（IACUC：ZN2021119）的批准。 资助 本工作得到了湖北省自然科学基金创新与发展联合基金（资助编号：2025AFD238）和湖北省卫生健康委员会科研项目（资助编号：WJ2025M116）的支持。 利益冲突声明 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。 致谢 感谢biorender网站（https://www.biorender.com）提供的程序图绘制。感谢武汉大学中南医院急诊医学系、华中农业大学生物医学与健康学院以及生命科学技术学院的所有学生的宝贵帮助和支持。