《Mutation Research - Reviews in Mutation Research》：PCR based site-directed mutagenesis: An extensively used tool for the functional genomics studies in begomoviruses
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SDM结合PCR技术是解析 begomoviruses 基因功能的关键工具，用于研究病毒蛋白（如Rep、TrAP）在复制、致病性及宿主互作中的作用，为开发抗病毒策略和农业防控提供理论支持。
Gnanaprakash Jeyaraj | Alok Kumar | A. Swapna Geetanjali
印度泰米尔纳德邦Chengalpattu市Kattankulathur的SRM科学技术学院遗传工程系
摘要
定向突变（SDM）是一种重要的工具，可以快速高效地操纵DNA序列中的特定残基，以研究它们在蛋白质结构和功能中的作用。在用于此目的的多种技术中，SDM结合PCR因其简单性和有效性而被广泛使用，并且耗时较少。该技术使用携带所需突变的寡核苷酸引物对，在目标DNA序列中引入特定变化。 Begomovirus病毒单独存在或与卫星分子结合时，由于它们在全球范围内广泛存在于多种作物上，对全球农业构成了重大威胁。了解Begomovirus基因组和卫星分子上的基因功能是制定有效疾病控制策略的关键。基于PCR的SDM在揭示基因功能和疾病发展分子机制方面发挥了重要作用，通过理解Begomovirus病毒与宿主植物之间的动态相互作用。这为开发创新的抗病毒干预措施和可持续农业实践铺平了道路，以减轻这些具有重要经济价值的植物病原体对全球粮食安全和作物生产的影响。本综述简要总结了SDM的总体概念和方法，重点介绍了基于PCR的SDM及其在Begomovirus功能基因组学研究中的应用。
引言
Begomovirus属于Geminiviridae科，是高度破坏性的植物病原体，在世界热带和亚热带地区造成重大农业损失[1]，[2]。这些病毒具有环状单链DNA基因组，可以是单部分或双部分形式，主要通过白粉虱Bemisia tabaci传播[3]。大多数Begomovirus病毒与称为betasatellites和alphasatellites的卫星分子相关联，这些卫星分子可以增强病原性或调节宿主[4]，[5]。
与其他许多植物病毒不同，Begomovirus病毒具有紧凑的基因组，其中开放阅读框相互重叠，编码多功能蛋白质，这些蛋白质参与复制、移动、抑制RNA沉默以及操纵宿主细胞过程[6]，[7]，[8]。由于这些蛋白质的多功能性和基因结构重叠，理解它们的确切作用变得复杂。因此，功能基因组学方法对于解析单个病毒基因及其编码蛋白质在病毒感染和宿主相互作用中的作用至关重要。
在现有的反向遗传学工具中，基于PCR的定向突变（SDM）作为一种广泛使用且可靠的方法，用于在病毒基因组中引入特定的核苷酸替换、删除或插入[9]，[10]，[11]。SDM使研究人员能够精确地靶向病毒蛋白中的保守基序或功能域，并研究这些突变对感染性、症状表达、复制和宿主免疫逃逸的影响。在Begomovirus病毒的背景下，SDM在识别关键功能残基（如Rep (AC1)、TrAP (AC2)、Ren (AC3)、C4、CP (AV1)、V2和βC1）方面发挥了重要作用，这些残基已知能调节多种宿主-病毒相互作用。
本综述将Begomovirus病毒作为重点生物学框架，说明如何将基于PCR的SDM应用于紧凑的多功能病毒基因组，而不是对Begomovirus生物学进行全面综述。Begomovirus病毒具有紧凑的环状单链DNA基因组，其开放阅读框大量重叠。这种受限的基因组组织使它们成为基于PCR的SDM的理想模型系统，因为即使是很小的序列变化也能揭示病毒蛋白的不同功能[1]，[12]。SDM最常靶向的基因编码参与复制、病原性、抑制宿主防御和病毒移动的多功能蛋白质。Rep (AC1)对滚环复制至关重要，TrAP (AC2)作为转录激活剂并抑制RNA沉默，Ren (AC3)通过蛋白质-蛋白质相互作用促进病毒DNA积累[13]。C4作为病原性决定因子，干扰宿主信号通路，CP (AV1)介导基因组包装和细胞内运输，V2参与移动、沉默抑制和症状发展[14]。Betasatellite编码的βC1蛋白是症状表达的关键决定因子，也是宿主防御反应的重要调节因子[4]，[15]。
尽管之前已有基于PCR的SDM方法的综述，但大多数现有综述仅关注方法学工作流程。相比之下，本综述强调了SDM如何应用于解析紧凑且重叠的病毒基因组中的功能域、调控基序和宿主相互作用界面，突显了其作为功能基因组学中基于突变的发现工具的作用。本文全面概述了基于PCR的SDM在Begomovirus功能基因组学中的应用。我们整理并讨论了利用SDM来表征基因功能、识别关键氨基酸残基以及阐明致病机制和宿主操纵的案例研究。此外，我们还强调了这种突变方法在通过交叉保护或抗性育种开发减毒病毒株方面的相关性。
小节片段
定向突变：概述和基于PCR的方法
SDM已成为分子病毒学中的基本工具，可用于在DNA中引入特定的核苷酸变化，从而解析病毒基因和蛋白质的功能。自Hutchison和Smith于1978年首次使用寡核苷酸引物创建靶向突变以来[16]，SDM已发展成为一套高效的基于PCR的方法。图1总结了基于PCR和非基于PCR的定向突变策略。
重叠延伸PCR (OE-PCR)
重叠延伸PCR是一种常用的SDM技术，特别适用于引入内部突变。OE-PCR的主要优点在于它可以在不需要限制位点的情况下引入点突变、删除或插入，使其适用于各种模板[17]。然而，由于需要两步扩增过程和四种引物（包括两种携带突变的引物），该方法较为繁琐。
重组环PCR (RC-PCR)
RC-PCR通过消除末端修复或连接的需求改进了反向PCR。它利用两个重叠的PCR产物在体内重新结合形成环状质粒。该方法快速高效，间隙修复在E. coli中自然发生[20]。该方法的工作流程如图7所示。
重组PCR (R-PCR)
R-PCR通过仅使用两个重叠引物进一步简化了突变过程。线性产物被转化到E. coli中，在那里发生同源重组
SDM在Begomovirus功能基因组学研究中的应用
尽管许多研究已使用定向突变来表征Begomovirus基因的功能，但具体使用的基于PCR的突变策略因基因组组织、突变类型和实验目的而异。早期的功能研究主要依赖于重叠延伸PCR和基于限制位点的PCR方法来引入点突变、删除或截断。相比之下，基于整个质粒的方法
结论
SDM的应用，特别是基于PCR的方法，极大地推进了我们对Begomovirus遗传学、病原性和宿主相互作用的理解。通过允许对病毒基因组进行精确修改，SDM促进了关键病毒蛋白（包括NSP、Rep、CP和βC1）的功能表征。这些研究阐明了特定基序和域如何参与病毒复制、症状诱导和宿主防御逃逸。值得注意的是，冗余基因的发现
CRediT作者贡献声明
Gnanaprakash Jeyaraj：概念构思、文献调研、方法学、数据整理、初稿撰写、可视化。Alok Kumar：方法学、数据解释、审稿与编辑。A. Swapna Geetanjali：概念构思、监督、审稿与编辑、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
