仿生多孔硅用于合理设计的联合疗法，以诱导免疫原性细胞死亡

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Biomimetic porous silicon for rationally designed combination therapy to induce immunogenic cell death

三阴性乳腺癌（TNBC）治疗中，通过化疗联合光热疗法（CHT-PTT）利用包覆细胞膜和PEG的黑多孔硅纳米颗粒（BPSi NPs）实现协同治疗，筛选出最优药物（+）-JQ-1和最佳温度（45℃），证实其能有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD），改善肿瘤微环境免疫活性。

　　

西尔雅·萨雷拉（Silja Saarela）|埃米莉亚·哈波宁（Emilia Happonen）|米拉-伊达·拉里（Milla-Iida Laari）|明娜·西沃宁（Minna Sivonen）|穆罕默德·扎基尔（Mohammed Zakir）|莎盖耶格·萨巴（Shaghayegh Saba）|扬内·坦皮奥（Janne Tampio）|刘瑞贤（Ruixian Liu）|尤哈·克莱夫斯特伦（Juha Klefstr?m）|卡佳·帕尤拉（Katja Pajula）|克里斯蒂娜·M·胡图宁（Kristiina M. Huttunen）|维萨-佩卡·莱赫托（Vesa-Pekka Lehto）|徐武军（Wujun Xu）

东芬兰大学技术物理系，Yliopistonranta 8，70211，库奥皮奥，芬兰

摘要

triple-negative乳腺癌（TNBC）由于对受体靶向治疗的反应较差以及肿瘤微环境的免疫抑制作用，预后较差。联合化疗和光热疗法（CHT-PTT）在治疗转移性癌症方面具有很大的潜力，可以提高治疗效果。该方法能够协同诱导免疫原性细胞死亡（ICD），同时改善肿瘤微环境的抑制作用。然而，如何最佳地设置CHT-PTT以诱导ICD仍不清楚。在本研究中，使用了涂有细胞膜的黑色多孔硅作为药物载体和光热转换剂。细胞膜涂层实现了仿生同型靶向。测试了六种具有不同抑制机制的化疗药物对TNBC细胞的ICD诱导效果，并评估了温度对CHT-PTT的影响。结果发现，(+)-JQ-1是最优药物，45°C的温和高温是诱导ICD的最佳温度设置。因此，本研究提供了一种合理设计的CHT-PTT方案，用于高效治疗癌症。

引言

大约15%的乳腺癌被归类为三阴性乳腺癌（TNBC）。¹ TNBC缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2（HER2），而这些受体是治疗药物的主要分子靶点。因此，缺乏有效的靶向治疗导致预后不良和总体生存率降低。^{1, 2} TNBC通常通过常规化疗（CHT）和放疗来抑制原发肿瘤的生长和扩散。³ 然而，这些传统治疗方法具有严重的副作用，并且对抑制肿瘤转移效果不佳，这突显了新疗法的重要性。^{1, 3} 免疫疗法是治疗转移性癌症的一种有前景的方法。尽管具有潜力，但由于大多数肿瘤的免疫抑制微环境，其治疗效果有限。⁴ 诱导免疫原性细胞死亡（ICD）是一种有效的增强肿瘤抗原产生的方法。⁵ ICD的特点是释放损伤相关分子模式（DAMPs），如钙网蛋白（CRT）和高迁移率盒1（HMGB1）蛋白。⁶ 当癌细胞发生ICD时，CRT从内质网（ER）转移到细胞表面，起到“吃我”的信号作用。^{4, 7} 同时，HMGB1从细胞核释放到细胞外空间。^{6, 7} 这些ICD标志物可以招募抗肿瘤免疫细胞^{7, 8}，从而使肿瘤微环境从免疫“冷”状态转变为“热”状态。⁴

ICD可以通过CHT和物理治疗方法（如光热疗法（PTT）来诱导。⁹ 化疗药物可以通过全身循环轻松到达身体不同组织。¹⁰ 然而，由于非特异性分布，它们往往会引发多种副作用并导致化疗耐药性。^{11, 12} 相比之下，PTT是一种非侵入性治疗方法^{13, 14}，它利用纳米颗粒（NPs）作为光热转换剂（PCAs），将光子的能量转化为局部高温来杀死癌细胞。^{15, 16} PTT通常使用650–900纳米的近红外（NIR）激光作为光源，因为这种激光可以深入组织。¹⁷ PTT通过促进细胞因子的释放和诱导ICD来激活抗肿瘤免疫反应。^{6, 16} 但对于已经扩散的肿瘤，转移可能发生在不同部位和不同肿瘤阶段。¹⁸ 小型或深部组织的转移很难通过NIR光达到。¹⁹ CHT和PTT各自的局限性促使人们结合两者的优点以实现协同治疗。由于激活了不同的通路，联合CHT-PTT可以降低药物剂量、减少副作用并减弱化疗耐药性。⁹ 尽管多项研究证实了联合CHT-PTT在诱导ICD方面的有效性，但这些研究中通常只选择了一种药物。此外，PTT的不同温度对联合治疗有显著影响²⁰，但这尚未得到系统研究。因此，目前还缺乏合理设计CHT和PTT联合治疗的方案。

黑色多孔硅（BPSi）纳米颗粒（BPSi NPs）具有生物相容性，表面积和孔体积较大^{13, 21}，允许高药物装载量和持续的药物释放。^{11, 16} 由于其高度吸光的黑色特性，BPSi NPs具有较高的光热转换效率（33.4%）。¹³ 因此，它们可以作为CHT-PTT中的药物载体和PCAs。此外，BPSi NPs的表面可以轻松修饰以具备多种生物功能^{13, 22}。例如，像其他类型的纳米颗粒一样²³，在BPSi NPs上涂覆聚乙二醇（PEG）可以改善其胶体稳定性和被动肿瘤靶向性²⁴。最近，开发了一种新的混合仿生涂层策略，结合了PEG和癌细胞膜（CMs），使纳米颗粒具有同型靶向性²⁵。然而，到目前为止，尚未研究BPSi NPs在联合CHT-PTT中的应用。

在本研究中，我们采用了一种合理的CHT-PTT方案设计，利用仿生BPSi NPs作为药物载体和PCAs来协同诱导ICD（图1）。首先，选择了六种具有不同ICD诱导机制的已知化疗药物，包括米托蒽醌（MTX）、多柔比星（DOX）、紫杉醇（PTX）、达沙替尼（DAS）、奥米帕利西布（GSK）和(+)-JQ-1（JQ1）（图1）。接下来，将游离药物的IC₅₀浓度与基于BPSi的PTT结合，以评估其ICD诱导能力。然后，选择最优药物并将其装载到具有PEG和CMs混合涂层的仿生BPSi NPs中。通过研究温度的影响，进一步优化了联合CHT-PTT。研究过程中，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像验证了ICD诱导能力。

部分内容片段

CM的提取

CM的提取遵循了Liu等人（2021年）先前发表的方法。²⁶ 简而言之，MDA-MB-231细胞（TNBC细胞系）在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco?，Thermo Fisher Scientific，美国）和1%青霉素（Gibco?，Thermo Fisher Scientific，美国）的RPMI（1640 w/l-Glutamine，Biowest，法国）培养基中培养。当细胞覆盖率达到一定程度后，使用胰蛋白酶-EDTA（Gibco?，Thermo Fisher Scientific，美国）分离细胞并清洗

物理化学表征

BPSi颗粒是通过一种新的NaK合金还原方法制备的。球磨后，BPSi NPs被氧化，在表面形成Si-OH基团，从而便于后续的PEG化处理。接下来，在湿法蒸发过程中对NPs进行CM涂层和药物装载（图1）。根据公式（1），每个NPs的质量对应的蛋白质量为0.375 ± 0.044 mg/mg（n = 3）。

图2a显示，与OH-BPSi相比，PEG化和CM涂层后NPs的流体动力学直径分别增加了约20 nm和40 nm

讨论

结合PEG和癌细胞来源的CM的混合仿生涂层作为一种新的纳米颗粒同型靶向策略引起了兴趣。²⁵ 带有CM涂层的纳米颗粒由于具有特定的细胞粘附分子（如E-和N-钙粘蛋白），能够高效地进行同型靶向^{37, 38}，从而与肿瘤细胞上的相同分子发生同源结合。³⁹ 实验结果证实了NPs的PEG和CM涂层成功（图2b和e），表明其良好的胶体性能

CRediT作者贡献声明

西尔雅·萨雷拉（Silja Saarela）：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析。埃米莉亚·哈波宁（Emilia Happonen）：研究。米拉-伊达·拉里（Milla-Iida Laari）：研究。明娜·西沃宁（Minna Sivonen）：数据分析、研究、可视化。穆罕默德·扎基尔（Mohammed Zakir）：研究。莎盖耶格·萨巴（Shaghayegh Saba）：研究。扬内·坦皮奥（Janne Tampio）：数据分析、研究。刘瑞贤（Ruixian Liu）：资源协调。尤哈·克莱夫斯特伦（Juha Klefstr?m）：资源协调。卡佳·帕尤拉（Katja Pajula）：资源协调。克里斯蒂娜·M·胡图宁（Kristiina M. Huttunen）：资源协调。维萨-佩卡·莱赫托（Vesa-Pekka Lehto）：撰写——审稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了芬兰研究委员会（Grant no. 356056、359706、356992）和芬兰癌症基金会（Grant No. 230130）的资助。库奥皮奥生物中心和芬兰生物中心的细胞与组织成像单元、药物发现与化学生物学（DDCB）平台、生物化学实验室以及UEF的SIB实验室提供了技术支持。