P-糖蛋白底物对体外模型中β-淀粉样肽跨内皮转运的影响

《Neuroscience》：Impact of P-glycoprotein substrates on transendothelial transport of amyloid-β peptide in an in vitro model

阿尔茨海默病（AD）中P-糖蛋白（P-gp）介导的Aβ转运机制研究，通过体外内皮细胞单层模型比较不同细胞系的屏障完整性，优化培养条件后测试P-gp底物（地高辛、兰索拉唑、阿托伐他汀、mirabegron）对Aβ跨内皮转运的影响，发现部分底物促进或抑制Aβ清除，与AD风险相关。

　　

约瑟夫·阿桑特（Joseph Asante）| 史蒂文·W·巴格尔（Steven W. Barger）

美国阿肯色州小石城阿肯色大学（University of Arkansas at Little Rock）生物信息学研究生项目，邮编72205

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种普遍的神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因，与大脑中β-淀粉样肽（Aβ）的积累密切相关。在大多数情况下，这种聚集主要是由于Aβ的降解和清除效率低下，尤其是其穿过血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）进入血液的过程存在问题。本研究探讨了P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）在转运Aβ过程中的作用，P-gp是负责将Aβ转运穿过内皮细胞单层的关键转运蛋白。通过单培养和非接触共培养技术对内皮血管壁的体外模型进行了测试，优化了增强屏障完整性的条件，评估指标包括跨内皮电阻（Transendothelial Electrical Resistance, TEER）和右旋糖酐泄漏试验。hCMEC/D3细胞系与原代人脑微血管内皮细胞（Human Brain Microvascular Endothelial Cells, HBMEC）进行了比较，结果显示后者具有更强的屏障完整性。优化了细胞密度和培养时间。在P-gp底物地高辛（digoxin）、兰索拉唑（lansoprazole）和米拉贝隆（mirabegron）存在的情况下，测试了荧光标记的Aβ_1–40的转运情况。地高辛、兰索拉唑和米拉贝隆显著增加了Aβ的转运，而米拉贝隆则抑制了这一过程，这些效应与其在人类患者中的应用风险一致。这些发现表明P-gp底物可能对Aβ的转运产生不同影响，为阿尔茨海默病的治疗提供了理论依据。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种隐匿且普遍的神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因，也是与年龄相关的功能障碍的重要因素。其发病机制与β-淀粉样肽（Aβ）的聚集密切相关，这一现象已得到大量组织学、生化和遗传学证据的证实（Hardy和Selkoe, 2002; Karran和De Strooper, 2022）。Aβ是淀粉样前体蛋白正常代谢的副产物，但通过典型的蛋白质稳态机制（如泛素-蛋白酶体系统）无法有效降解。因此，它主要通过血脑屏障（BBB）进入循环系统进行清除，这一过程中的异常会导致Aβ在中枢神经系统（CNS）中积累。中枢神经系统Aβ稳态水平的升高被认为是散发性阿尔茨海默病（占所有病例的约95%）的发病原因（Bell等人, 2007）。

血脑屏障（BBB）作为中枢神经系统与全身循环系统的分界界面，对大脑微环境的复杂平衡起着关键作用。它由内皮细胞单层构成，这些细胞覆盖在脑血管表面，通过紧密的细胞间连接来维持大分子的水溶性物质的跨细胞转运（Cecchelli等人, 2007; Sweeney等人, 2018; Zenaro等人, 2017）。对于那些具有足够亲脂性的物质来说，它们可以通过内皮细胞膜进入中枢神经系统；而它们的排出则依赖于BBB中的一个功能性生化成分——ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）。P-gp不仅因其对中枢神经系统稳态的保护作用而受到关注，还因其在清除大脑中Aβ中的作用而受到广泛研究（Cirrito等人, 2005; Hartz等人, 2010; Wang等人, 2016）。

据推测，P-gp至少具有两个用于将外源物质泵出细胞膜的结合位点。具有相同结合位点的底物会竞争性地抑制彼此的转运，而具有不同结合位点的底物则可能促进彼此的转运（Ferreira等人, 2017; Ferreira等人, 2013; Shapiro和Ling, 1997）。在作为P-gp底物的药物中，有些可能通过竞争结合位点来抑制Aβ的转运，从而导致其在大脑中的积累；相反，其他药物则可能通过与P-gp不同结合位点的结合来增强Aβ的清除。了解Aβ与P-gp底物的相互作用可能有助于减少Aβ的积累，从而降低阿尔茨海默病的发病率。

在这里，我们通过测试Aβ在内皮细胞单层中的从基底侧向顶侧的转运速率来模拟从大脑向血液的转运过程，并最终探讨其他P-gp底物同时存在时的影响。这项工作需要开发相应的实验方法，包括测试不同的细胞类型和培养条件、评估分子泄漏情况、跨内皮电阻（TEER）以及量化方法。一些底物对Aβ跨细胞转运的影响与其对阿尔茨海默病发病率的影响一致（Asante等人, 2025）。

部分内容摘要

化学物质和试剂

完整的细胞培养基包括内皮细胞培养基（Endothelial Cell Medium, ECM）、5%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、0.1%内皮细胞生长补充剂（Endothelial Cell Growth Supplements, ECGS）以及青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin, P/S），均由ScienCell公司提供。转移测定缓冲液（Transfer Assay Buffer, TAB）为实验室自制，由Hank’s缓冲盐溶液（5.5 mM D-葡萄糖）加入0.5% BSA和25 mM HEPES（pH 7.2）配制而成。用于转运测定的关键分子包括右旋糖酐-594（平均分子量：10 kDa）。

细胞通透性系统

细胞培养采用了两种方法：一种是直接将细胞接种在多孔膜上（附着在Transwell孔板上）；另一种是非接触共培养技术，即细胞接种在同一类型的多孔膜上，同时将星形胶质细胞接种在孔板的底部。随后，小心地切下含有细胞的部分膜。

总体发现与解释

本研究的结果揭示了Aβ与P-gp之间的复杂相互作用及其对阿尔茨海默病的潜在影响。大多数证据表明，Aβ在大脑中的滞留是导致阿尔茨海默病的重要因素。P-gp在促进Aβ从脑血管内皮细胞顶侧膜转运过程中起着关键作用（Cirrito等人, 2005; Hartz等人, 2010; Wang等人, 2016）。因此，P-gp似乎与LDL受体相关蛋白及其他受体协同作用，共同参与Aβ的转运。

CRediT作者贡献声明

约瑟夫·阿桑特（Joseph Asante）： 负责数据分析、研究设计、方法论制定和初稿撰写。 史蒂文·W·巴格尔（Steven W. Barger）： 负责论文修订与编辑、验证、项目管理、方法论完善、数据整理以及概念框架的构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了阿肯色大学医学院（University of Arkansas for Medical Sciences College of Medicine）通过神经退行性疾病创新中心（Neurodegeneration Creativity Hub）的支持。

术语表

Aβ

β-淀粉样肽

AD

阿尔茨海默病

ABC

ATP结合盒

BBB

血脑屏障

BSA

牛血清白蛋白

CNS

中枢神经系统

CSF

脑脊液

DMSO

二甲基亚砜

ECGS

内皮细胞生长补充剂

ECM

内皮细胞培养基

FBS

胎牛血清

HBMEC

人脑微血管内皮细胞

hCMEC/D3

免疫人脑内皮细胞系

HFIP

1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇

HEPES

4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸

MEM

最小必需培养基

TAB

转移缓冲液