中华萘酚甲醚通过抑制凝血因子XII来阻断凝血的内源性途径，从而预防血栓形成

《Phytomedicine》：Chinensinaphthol methyl ether prevents thrombosis by inhibiting the intrinsic pathway of coagulation through targeting coagulation factor XII

本研究发现，化合物CME通过抑制F12凝血因子激活，同时减少血小板聚集，有效预防动脉血栓形成，且出血风险低，为复杂血栓疾病提供新药候选。

　　

张慧|张婷|周盼瑶|刘雅婷|陈思怡|雷周轩|苏金玉|葛敬新|叶玲|李子瑶|杨彦芳|吴和珍|刘波

湖北中医药大学药学院，武汉，430065，中国

摘要

背景

血栓性疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一。凝血和血小板聚集的失调是血栓形成的关键因素。识别同时针对血小板聚集和凝血的有效药物对于改善治疗结果至关重要。

方法

我们评估了来自Rostellularia procumbens (L.) Nees的木脂素Chinensinaphthol甲基醚（CME）的抗血栓特性体内。通过血小板蛋白质组学分析，我们评估了CME对凝血和血小板活化蛋白的影响。还进行了肝脏转录组学和血浆蛋白质组学分析，以研究CME对凝血因子表达的影响。分子对接、差示扫描荧光法（DSF）和生物层干涉法（BLI）被用来确定CME的靶点。此外，还进行了分子动力学模拟和氨基酸突变研究，以了解CME的结合机制。

结果

CME表现出显著的抗血栓效果，抑制了血小板聚集和内源性凝血途径。血小板蛋白质组学分析显示，补体-凝血级联反应中的蛋白质显著下调。肝脏和血浆蛋白质组学分析表明，CME不影响凝血因子的转录或表达。分子对接和其他检测方法证实，凝血因子ⅩⅡ（F12）是CME的主要靶点。分子动力学和突变研究揭示，CME与F12的FnI结构域结合，阻止其激活为F12a，从而防止凝血系统的激活。

结论

本研究首次阐明了木脂素化合物CME通过靶向F12发挥抗血栓作用机制。其“双重效果和低出血风险”避免了临床联合治疗相关的出血风险，为血栓性疾病提供了一种新型的小分子候选药物，并填补了针对F12的天然小分子研究的空白。

引言

全球心血管疾病（CVD）的发病率和死亡率逐渐上升。1990年至2019年间，患有CVD的人口从2.71亿增加到5.23亿，CVD相关死亡人数从1210万增加到1860万（GBD 2019慢性呼吸系统疾病协作组，2023年）。实际上，CVD是全球主要的死亡原因（Roth等人，2017年）。除了给患者家庭带来经济负担外，CVD也是全球卫生保险政策的重大负担，并且作为公共卫生问题的重要性日益凸显。

CVD发展的一个关键风险因素是血栓形成。血栓形成的病理生理过程始于血管内皮细胞的退化、坏死和脱落，这随后激活了F12。F12在与带负电荷的表面接触后转变为活化状态，启动内源性凝血途径。同时，受损血管的内皮变得粗糙，血小板活化、黏附并聚集，释放多种血小板因子。内源性凝血途径和血小板的协同激活触发了局部血液凝固，形成血栓。

F12与动脉粥样硬化病变和血栓性疾病有关（Didiasova等人，2018年）。F12缺乏的小鼠以及接受F12a抑制剂治疗的小鼠在中风、动脉粥样硬化和肺栓塞模型中的存活率显著提高；重要的是，这些小鼠不会出现出血并发症。F12缺乏的小鼠还与动脉粥样硬化病变和血栓性疾病的发展有关（Davoine等人，2020年）。临床上，抗血小板药物和抗凝剂可以抑制血栓形成，减少急性心肌梗死的发病率和死亡率，并预防急性冠状动脉综合征等血栓性疾病。通常，抗血小板聚集药物和抗凝剂是分开使用的，但某些复杂疾病需要两者联合使用。例如，根据《冠心病合理使用指南》（Trenckmann等人，1985年），同时患有冠状动脉疾病和心房颤动的患者需要同时进行抗血小板和抗凝治疗；这是因为冠状动脉疾病相关的血栓富含血小板，需要抗血小板治疗，而心房颤动患者的血栓类似于静脉血栓，需要抗凝治疗。治疗冠状动脉疾病合并心房颤动较为困难，因为这两类药物不能完全替代彼此，联合抗血栓治疗会在一定程度上增加患者的出血风险。只有indobufen被证明具有抗血小板聚集和抗凝作用，其对纤溶原的抑制作用比达比加群酯更强。纤溶原或F2是内源性和外源性凝血途径的最后一步关键酶，抑制这种酶会导致凝血功能障碍。因此，indobufen具有胃肠道和鼻出血等不良反应。如果F12被用来抑制内源性凝血途径而不影响外源性凝血途径，出血风险将会降低。

R. procumbens属于爵床科（Acanthaceae）的Justicia属植物。作为一种药用植物，它被用来促进血液循环以消除瘀血、清热解毒并利尿消肿。现代研究表明，它具有多种药理活性，包括抗血小板聚集、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗炎和抗氧化作用（Kim等人，2025年）。迄今为止，从该植物中分离出了85种木脂素及其苷类、15种黄酮类、4种生物碱、9种萜类和36种其他化合物（Guan等人，2025年）。其中，其特征成分主要是木脂素；例如，Justicidin B和CME具有抗血小板聚集作用。CME是从R. procumbens中分离出的主要木脂素化合物（Liu等人，2018年）。当代药理学研究证明（Luo等人，2014年），CME具有抗氧化特性（Chiorcea-Paquim等人，2020年），通过细胞毒性作用抑制人类白血病细胞系K562和RAW264.7的增殖（Fukamiya等人，2020年；Day等人，2000年），并防止兔子的花生四烯酸引起的血小板聚集。我们团队之前的研究表明，CME可以抑制各种诱导剂引起的兔子血小板聚集体外（美国神经外科医师协会等人，2018年），根据微尺度热泳实验验证了其与人类血小板细胞膜蛋白integrin α_IIbβ₃的结合体外（Wu等人，2019年；Zhang等人，2020年），并防止大鼠尾部角蛋白引起的血栓形成。在这项研究中，我们使用三氯化铁（FeCl₃）诱导的SD大鼠颈动脉血栓模型来研究CME抑制动脉血栓形成的机制。内源性凝血系统由FeCl₃引起的内膜-介质损伤激活，导致血小板黏附和聚集，形成类似于临床病理动脉血栓形成的复合血栓。

阿司匹林、氯吡格雷和其他抗血小板聚集药物目前已在临床上使用。只有依诺肝素钠被归类为靶向F12的药物，因为它同时针对凝血因子F2a、F10a等。然而，这种药物有出血的不良反应。目前仍在进行仅针对F12的抑制剂的临床试验，尚未有关于同时抑制内源性和血小板聚集的药物的研究。由于CME是一种体积小、易于制备的分子，并且具有双重抗血栓机制，预计它将成为治疗复杂血栓性疾病的有希望的药物。

章节片段

化学物质和试剂

CME（纯度>98%）是在实验室内部制备的。阿司匹林肠溶片购自Cspc Ouyi Pharmaceutical Co., Ltd.（中国石家庄）。达比加群酯胶囊购自Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG（德国因格尔海姆）。TMT10Plex、乙腈LC/MS、甲醇LC/MS和甲酸LC/MS购自ThermoFisher Scientific（美国沃尔瑟姆）。腺苷二磷酸和血小板活化因子购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。

CME抑制SD大鼠中FeCl₃诱导的颈动脉血栓形成

血液的高凝状态是静脉血栓形成的关键因素。早期实验室研究表明，CME可以抑制SD大鼠尾静脉中的血栓形成，可能有助于缓解高凝状态，尽管具体机制尚不清楚。CME可以在体外与血小板膜受体integrin α_IIbβ₃结合，从而抑制血小板聚集。这些发现表明CME具有抵抗复杂血栓形成的潜力。我们使用了FeCl₃诱导的

讨论

初步的实验室研究表明，CME可以在体外与血小板结合并发挥抗血小板聚集作用（Liu等人，2022年）。由CME组成的R. procumbens精制提取物可以在体内抑制卡拉胶诱导的大鼠尾血栓形成（Zhang等人，2020年）。CME在该提取物中含量较高，也是R. procumbens中的主要木脂素成分之一。这种单体化合物是否直接发挥抗血栓作用以及其

结论

CME是一种从R. procumbens中分离出的天然小分子化合物，具有强大的抗血小板聚集和内源性抗凝活性。其抗血栓效果显著优于阿司匹林。CME特异性地靶向F12，CME与F12的结合域位于FnI结构域内。CME与内皮损伤暴露的表面结合位点竞争性结合，有效抑制F12的激活。

数据可用性

本研究生成的所有数据均包含在手稿和补充文件中。

资助

本工作得到了湖北省自然科学基金（2024AFD249）的支持。

作者贡献

张慧：参与实验设计并主导了大部分实验，撰写了论文。张婷：参与实验并提供医学建议。周盼瑶：参与RT-PCR和ELISA实验。刘雅婷：参与数据分析、体内实验和分子对接。陈思怡：体内实验。雷周轩：参与体内实验。苏金玉：参与体内实验。葛敬新：参与体内

未引用的参考文献

Sacks等人，2018年；Fukamiya和Lee，1986年

CRediT作者贡献声明

张慧：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。张婷：监督、方法学、概念化。周盼瑶：验证。刘雅婷：验证。陈思怡：验证。雷周轩：验证。苏金玉：验证。葛敬新：验证。叶玲：验证。李子瑶：验证。杨彦芳：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。吴和珍：撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

我们声明与可能不当影响我们工作的其他人或组织没有财务和个人关系，对任何产品、服务和/或公司没有专业或其他性质的个人利益，这些利益可能会影响本文所述内容或对其的评审。

致谢

作者感谢湖北省中医药资源与化学重点实验室在实验过程中提供的便利。作者感谢湖北省自然科学基金和湖北中医药大学的财政支持。作者感谢编辑和审稿人的建议，这些建议极大地改进了本文。我们声明这项工作是由上述作者完成的