黄芪甲苷IV通过调节14-3-3η/GPX4轴，减轻心肌缺血/再灌注损伤，降低线粒体功能障碍、铁死亡（ferroptosis）和细胞凋亡（apoptosis）

《Phytomedicine》：Astragaloside IV mitigates myocardial ischemia/reperfusion injury by modulating the 14-3-3η/GPX4 axis, reducing mitochondrial dysfunction, ferroptosis, and apoptosis

心肌缺血再灌注损伤机制及Astragaloside IV调控14-3-3η/GPX4轴保护作用研究。

　　

曾瑞元|邱志聪|赵世涛|赖松青|邱荣斌|吴子明|徐志强|李建楠|罗旭东|王博龙|李婉

江西省南昌大学第一附属医院心血管外科，中国江西南昌330006

摘要

背景

急性心肌梗死（AMI）需要及时恢复心脏灌注，这通常会导致心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）。铁死亡、凋亡和线粒体功能障碍在这一过程中起着关键作用。黄芪甲苷IV（Ast）已被证明具有多种生物活性，但其对抗MIRI的保护机制仍不清楚。

目的

本研究旨在探讨Ast对MIRI的保护作用及其潜在机制。

方法

本研究利用H9c2细胞缺氧/再氧合（A/R）模型和Sprague-Dawley（SD）大鼠MIRI模型来评估Ast的保护效果。通过超声心动图、HE染色和TTC染色评估心脏损伤；通过DHE染色评估超氧化物水平；通过TUNEL染色评估凋亡；通过Western blotting评估蛋白质表达。使用商业试剂盒检测铁死亡、凋亡和线粒体功能相关指标，并通过TEM观察线粒体超微结构。通过共聚焦显微镜和Co-IP研究14-3-3η和GPX4的表达、定位和相互作用。

结果

Ast预处理显著减轻了MIRI后的LVEF和LVFS下降，减少了心肌梗死面积，降低了ROS和亚铁离子的积累，改善了铁死亡标志物（GPX4、PTGS2）和脂质过氧化指标（MDA、4-HNE）的变化，提高了Bcl-2/Bax比率，并维持了线粒体功能参数（NDUFB8、UQCRC2、MMP）。此外，Ast预处理上调了14-3-3η的表达，并增强了其与GPX4的相互作用，14-3-3η通过调节其泛素化来调控GPX4的稳定性。

结论

本研究表明，Ast通过调节14-3-3η/GPX4轴来改善MIRI中的铁死亡、凋亡和线粒体功能障碍，从而保护心肌组织。

引言

AMI是全球主要的死亡原因之一，每年导致数百万人死亡（Anderson和Morrow，2017）。当心肌缺血持续时间超过20分钟时，从心内膜到心外膜会发生不可逆的心肌细胞死亡（Peng等人，2024）。及时有效的再灌注治疗是改善AMI患者预后的主要方法（Murphy和Goldberg，2022）。然而，缺血组织的再灌注可能会引起额外的损伤，即I/R损伤，这会显著影响患者的预后（Binder等人，2015；Xie等人，2024）。近年来，随着对I/R研究的深入，提出了几种关于其机制的假说。越来越多的证据表明，调控性细胞死亡（RCD），包括铁死亡（Lillo-Moya等人，2021；Wu等人，2021a；Zhai等人，2021）、坏死和凋亡，在心肌MIRI中起着重要作用（Yang等人，2024）。除了调控性细胞死亡外，还有许多其他机制参与心肌I/R损伤的调节，包括钙超载（Pereira等人，2014；Wu等人，2021b）、炎症反应（Lillo-Moya等人，2021）、内质网应激、活性氧（ROS）生成（Bugger和Pfeil，2020；Wu等人，2020）和线粒体功能障碍（Panconesi等人，2022）。越来越多的研究表明，中医（TCM）疗法可以减轻I/R损伤并显著改善心脏泵功能，从而改善患者预后（Ge等人，2023；Hu等人，2024a；Hu等人，2024b；Yang等人，2024；Zhang等人，2025）。

Ast是从传统中药黄芪中提取的一种活性成分，具有多种生物活性。研究表明，Ast不仅可以促进骨形成和血管生成（Wang等人，2021），保护神经系统（Yao等人，2023），抑制肿瘤发生（Liang等人，2023a），还可以通过调节AMPKα2通路来对抗多柔比星引起的心脏毒性（Hu等人，2024c）。其衍生物HHQ16可以改善梗死引起的心肌细胞肥大和心力衰竭（Wan等人，2023）。此外，Ast已被证明可以通过抑制铁死亡来减轻脑I/R损伤（Wang等人，2023），并通过改善线粒体功能障碍来减轻糖尿病肾病中的足细胞凋亡（Shen等人，2023）。然而，Ast抑制铁死亡和减轻心肌I/R损伤的具体机制尚未完全阐明。探索其潜在的分子机制将有助于更好地利用Ast对心肌I/R损伤的保护作用，从而改善相关患者的预后。

铁死亡是一种新型的铁依赖性、非凋亡性的调控性细胞死亡，最初由Scott J. Dixon团队在2012年发现（Dixon等人，2012）。铁死亡的特点是ROS过度产生、Fe²⁺积累和脂质代谢异常（Yang等人，2024）。经历铁死亡的细胞通常表现出线粒体异常，如线粒体浓缩或肿胀、膜密度增加、嵴减少或缺失以及外膜破裂（Dixon等人，2012；Friedmann Angeli等人，2014；Yagoda等人，2007）。线粒体是细胞内ROS的主要来源，线粒体ROS的产生可能通过促进脂质过氧化来促进铁死亡（Zheng和Conrad，2020）。当心肌细胞经历缺血时，线粒体电子传递链产生的电子无法转移到分子氧上。最终结果是氧化磷酸化停止和线粒体三磷酸腺苷（ATP）合成受到抑制（Di Lisa等人，2007；Halestrap等人，2004；Murphy和Steenbergen，2008）。随着氧化磷酸化的抑制，心肌细胞只能通过无氧糖酵解来供应ATP，导致细胞内乳酸积累。此时，为了维持正常的pH值，细胞内的Na⁺/H⁺交换器和Na⁺/Ca²⁺交换器会减少细胞内的H⁺并增加Ca²⁺。细胞内的过量Ca²⁺会通过线粒体Ca²⁺单向转运蛋白进入线粒体基质，导致线粒体Ca²⁺积累（Murphy和Steenbergen，2008；Weiss等人，2003）。这会导致mPTP大量开放，使大量水进入线粒体，导致线粒体肿胀，损害线粒体功能，甚至导致线粒体破裂。受损的线粒体会通过释放细胞色素c来激活caspase，从而触发凋亡（Borutaite和Brown，2003；Newmeyer和Ferguson-Miller，2003）。在缺血期间，受损的线粒体会通过Complex I和III显著增加ROS的产生，这与再灌注期间发生的ROS爆发一起，加剧了I/R过程中的心肌损伤（Baines，2009）。

14-3-3家族的多功能调控蛋白存在于所有真核生物中。这是一个进化上保守且高度丰富的调控分子家族，可以通过识别这些配体中的线性磷酸化与多种不同的配体蛋白相互作用，从而影响细胞定位、信号转导、细胞周期、转录等过程（Aitken，2006）。几乎所有真核生物都表达多个14-3-3同源物。人类有七个同源物，分别用希腊字母β、γ、ε、ζ、η、τ和σ表示。其中，14-3-3η已被证明具有多种生物活性。例如，在类风湿关节炎的相关研究中，14-3-3η已被证明可以通过FOXO3-Snail轴促进类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的侵袭足形成（Kadiri等人，2021），并且针对14-3-3η的自身抗体被认为是早期类风湿关节炎的诊断标志物（Maksymowych等人，2015）。除了在发育中的作用外，14-3-3η还可以促进抗病毒先天免疫（Lin等人，2019），抑制甲状腺激素诱导的线粒体自噬（Cui等人，2024）和心肌细胞中的线粒体介导的凋亡（Sreedhar等人，2015），并且已被证明可以通过维持线粒体稳态来减轻MIRI（Huang等人，2018；Liu等人，2018）。

我们实验室的最新研究发现，14-3-3η可以抑制MIRI中的铁死亡和凋亡。然而，涉及的具体机制以及Ast是否可以通过调节14-3-3η来发挥其作用仍不清楚（Hu等人，2024b）。因此，我们在H9c2细胞中使用A/R模型和SD大鼠的MIRI模型，研究了14-3-3η是否调节GPX4，以及Ast是否通过14-3-3η/GPX4轴来减轻心肌I/R损伤。

材料

Ast（纯度≥98%，批次编号DH0015）购自成都德思特生物科技有限公司（中国成都）。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1，商品编号HY-100579）和抗氧化剂Mito-TEMPO（商品编号HY-112879）均购自MedChemExpress。针对14-3-3η和GPX4的小干扰RNA（siRNAs）以及非特异性siRNA对照由Sangon Biotech（中国上海）合成。

动物实验

所有动物实验均获得了南昌大学第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号CDYFY-IACUC-2025092003）。所有实验动物均购自Slack Laboratory Animal Company（中国湖南）。选择了大约8周大、体重约250克的雄性SD大鼠。动物被饲养在12小时光照/黑暗周期的环境中，并提供充足的水和饲料。

MIRI的实验模型是通过

细胞培养

H9c2细胞购自细胞库/干细胞库（北京），并在Dulbecco改良的鹰培养基（DMEM，商品编号12100，Solarbio Science & Technology，北京）中培养，加入10%胎牛血清（FBS，商品编号ZQ0500，Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.，上海），培养条件为37°C和95% O₂及5% CO₂。

细胞转染

使用jetPRIME?试剂（Polyplus Transfection；商品编号101000006）将针对14-3-3η和GPX4的siRNA转染到H9c2细胞中

Ast预处理可减轻SD大鼠的MIRI

图1A显示了Ast的化学结构。为了确定Ast是否可以减轻SD大鼠的MIRI，我们通过灌胃给予不同剂量的Ast，然后诱导MIRI。图1B显示，在LAD闭塞后，左心室和心尖呈现苍白。超声心动图显示MIRI显著降低了SD大鼠的LVEF和LVFS。2.5 mg/kg的Ast剂量没有效果，而5 mg/kg的Ast显著改善了心脏功能（图1C-E）。同样，血清CK-MB和LDH

讨论

MIRI通常表现为缺血后心肌组织细胞受到更严重的损伤，随后血流恢复。再灌注不仅不能恢复心脏结构和功能，反而常常造成更严重的损伤。这种情况常见于心肌缺血疾病患者，导致不可逆的损伤（Zhang等人，2024a）。因此，阐明MIRI的具体分子机制对于开发缓解策略至关重要

结论

MIRI通过诱导线粒体功能障碍来损害心脏功能，从而触发铁死亡和凋亡。Ast预处理通过调节14-3-3η/GPX4轴来减轻这些效应，从而减少心肌细胞死亡和心脏功能障碍。这些发现为MIRI的分子机制提供了新的见解，并为开发靶向疗法提供了方向。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号82460057、82560074）和江西省自然科学基金（编号20232BAB206009）的支持。

数据和材料的可用性

本研究生成的数据可以向通讯作者索取。

作者贡献

曾瑞元：概念构思、数据管理、研究、方法学、验证、可视化、写作——审阅和编辑、初稿写作。邱志聪：数据管理、验证。赵世涛：概念构思、数据管理、研究、方法学、项目管理。赖松青：项目管理、正式分析、资金获取、监督。邱荣斌：验证、可视化。吴子明：数据管理。徐志强：验证。李建楠:

伦理批准和参与同意

本研究方案已获得南昌大学第一附属医院伦理委员会的审查和批准（批准编号CDYFY-IACUC-2025092003）。

出版同意

不适用。

CRediT作者贡献声明

曾瑞元：写作——审阅与编辑、初稿写作、可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念构思。邱志聪：验证、数据管理。赵世涛：项目管理、方法学、研究、数据管理、概念构思。赖松青：监督、项目管理、资金获取、正式分析。邱荣斌：可视化、验证。吴子明：数据管理。徐志强：验证。李建楠：

利益冲突声明

本手稿尚未在其他地方部分或全部发表，也未被其他期刊考虑。所有研究参与者均提供了知情同意，研究设计已获得适当的伦理审查委员会的批准。我们已阅读并理解了您的期刊政策，相信本手稿和研究均未违反任何规定。不存在需要声明的利益冲突。

致谢

不适用。