一种高再生能力的Malus robusta Rehd.基因型的鉴定及高效转化体系的建立

《Plant Science》：Identification of a high-regeneration Malus robusta Rehd. genotype and establishment of an efficient transformation system

本研究从‘Malus robusta’种子lings中筛选出高再生材料BL-57，优化叶再生及农杆菌介导转化系统，建立稳定基因编辑平台，为苹果砧木分子育种提供工具。

　　

许多张|潘琪|刘秋实|金敬贤|邢一婷|陈启璐|兰金城|李伟|李天中|王胜楠

中国农业大学园艺学院，北京，中国

摘要

转基因苹果品种可能带来环境安全问题，尤其是在花粉传播方面。将非转基因接穗嫁接到转基因砧木上是一种有前景的策略，可以在最大限度地减少通过花粉传播转基因风险的同时，结合所需的性状调控。在中国，Malus robusta Rehd. 是最常用的苹果砧木之一。然而，其转化效率和可重复性仍然有限。在本研究中，我们从 Malus robusta Rehd. 的幼苗中鉴定出一个高再生能力的基因型 BL-57，优化了叶片再生和农杆菌介导的遗传转化系统，最终建立了用于基因敲除和过表达的稳定转基因系统。叶片外植体最初在添加了 0.3 mg/L 6-苯基氨基嘌呤（6-BA）、0.2 mg/L 吲哚-3-乙酸（IAA）、0.1 mg/L 赤霉素 3（GA?）、30 g/L 蔗糖和 7.5 g/L 明胶的 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基上培养。叶片切割后，外植体被转移到含有 2 mg/L 硫代丁唑酮（TDZ）、0.5 mg/L 萘乙酸（NAA）、30 g/L 蔗糖和 7.5 g/L 明胶的 MS 培养基上，观察到了最高的再生效率，平均每个外植体可产生 15 个芽。被 Agrobacterium 感染的叶片外植体在添加了 6 mg/L 卡那霉素和 250 mg/L 头孢噻肟的芽诱导培养基上培养。再生出的小苗得到了鉴定和验证，证明了在 BL-57 中成功建立了基因敲除和过表达的转基因系统。总之，我们鉴定出了一个具有高再生能力的 M. robusta 基因资源，并建立了一个高效的叶片再生和转化系统。该平台为推进苹果的分子育种和功能基因组学研究提供了宝贵的工具。

引言

栽培苹果（Malus domestica Borkh.）是一种广泛种植的仁果类果树，主要分布在北半球和南半球的温带地区，近年来其栽培范围已扩展到亚热带和热带地区（Hanke 等，2017）。优质的苹果品种通常通过嫁接到选定的砧木上来无性繁殖，这种做法可以利用砧木的有益性状来提高适应性和抗逆性（Jensen 等，2010）。砧木的选择对于决定嫁接树木的活力、产量和抗性至关重要（Vaio 等，2009）。在中国，Malus robusta Rehd. 是最常用的砧木之一（Zhang 等，2013）。这种落叶植物属于蔷薇科 Malus 属，是 Malus baccata 和 Begonia 的杂交种，已有超过一千年的栽培历史。M. robusta 具有发达的根系、强的耐寒性和耐旱性、耐盐性和贫瘠土壤的能力，以及与多种苹果品种的优良嫁接兼容性（Shen 等，2015；Li 等，2013）。

近年来，生物技术的迅速发展为植物育种领域引入了许多新的技术和理论框架。其中，基因编辑工具能够精确且可预测地修改植物基因组，以引入所需的性状（Chen 等，2019）。这些技术为广泛植物物种的 DNA 序列进行合理和有针对性的改造提供了强大的手段（Zhu 等，2020；Jia 等，2014；Peng 等，2017；Ren 等，2016；Nakajima 等，2017；Wang X 等，2018；Wang Z 等，2018；Fister 等，2018）。自 1989 年首次成功培育出转基因苹果植株以来（James 等，1989），已经开发出了许多转基因苹果品种和砧木。这些包括 Green Sleeve（Li 等，2023）、M26（Lambert 等，1992）、Golden Delicious（Puite 等，1996）、Royal Gala（Cárdenas 等，2025；Chen 等，2022；Yao 等，1995）、Fuji（Seong 等，2008；Chen 等，2012）、Hanfu（Yang 等，2010）、A2（Zhu 等，2001a）、M9（Zhu 等，2001b）、JM2（Nishitani 等，2016）、Malus baccata（L.）（Wu 等，2011）。目前约有 60 种苹果克隆基因型可以进行遗传转化。

不同苹果品种的再生和转化效率存在显著差异。作为一种多年生木本植物，苹果树表现出高度的遗传杂合性（Janick 等，1996），这给从父母本产生具有所需性状的后代带来了挑战（Igarashi 等，2002）。农杆菌介导的叶片盘转化已成为实现苹果基因编辑的关键方法（Xia 等，2023）。然而，不定芽再生的效率受到基因型的强烈影响（Dai 等，2013；Shi 等，1999），直接影响转基因整合的成功（Duclercq 等，2011；Sugimoto 等，2011）。尽管 M. Robusta 在中国被广泛用作砧木，但它仍然缺乏高效且可重复的转化方法，限制了稳定转化系的可用性，阻碍了功能研究和分子育种工作（Li 等，2008；Zhu 等，2010）。

在本研究中，我们从 M. robusta 的幼苗群体中鉴定出一个高再生能力的基因型 BL-57。我们研究了不同激素组合对其增殖和再生效率的影响，并通过评估叶片方向和伤口处理方法进一步优化了再生方案。随后，通过优化关键参数（包括选择压力、农杆菌浓度和感染时间）改进了转化系统。结果，我们成功建立了 Malus robusta 的稳定转化系统，为优质苹果砧木的分子育种提供了理论和技术支持。

章节摘录

植物材料

Malus robusta Rehd. 的种子来自中国河北省张家口市怀来县一个果园中健康、生长旺盛的成年树木（年龄超过 10 年）（地理坐标：115.7490° E，40.2248° N）。经过层积处理后，3000 粒发育良好的种子（下胚轴长度在 2 mm 至 5 mm 之间）被种植在中国农业大学上庄实验站的冷棚中的培养基块中。从 4 月到 8 月，进行了标准的幼苗管理

筛选和鉴定高再生能力的 M. robusta 基因型

从 3000 株 M. robusta 幼苗中（图 S1），选出了 100 株健康的个体进行详细的表型分析。测量了形态特征，包括植株高度、茎直径、叶片长度和宽度以及枝条数量。随后，为 54 个选定的品系成功建立了无菌系统，并通过量化愈伤组织形成率、芽诱导频率和平均再生芽数量来评估它们的再生潜力

讨论

Malus robusta Rehd. 是一种传统的中国花楸树种，由于其多种优良性状而常被用作苹果的砧木（Hu 等，2021）。随着生物技术的进步（Velasco 等，2010），转基因方法已成为遗传改良的关键工具。尽管之前的研究已经探讨了 Malus robusta Rehd. 的种质选择（Li 等，2013）和遗传转化，但这些研究大多集中在抗逆性等性状上

结论

在本研究中，我们从 Malus robusta Rehd. 幼苗中鉴定出了一个高再生能力的基因型 BL-57。我们优化了基于叶片的再生和 Agrobacterium 介导的转化方案，最终建立了一个稳健的基因编辑系统。叶片外植体最初在添加了 0.3 mg/L 6-苯基氨基嘌呤（6-BA）、0.2 mg/L 吲哚-3-乙酸（IAA）、0.1 mg/L 赤霉素 3（GA?）、30 g/L 蔗糖和 7.5 g/L 明胶的 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基上培养。叶片

未引用的参考文献

(Cárdenas 和 Klein, 2025; Di Vaio 等, 2009; Hanke 和 Flachowsky, 2017; James 等, 2022; Jia 和 Wang, 2014; Lambert 和 Tepfer, 1992; Luo 等, 2016; Ma 等, 2016; Merrick 和 Fei, 2015; Murashige 和 Skoog, 1962; Puite 和 Schaar, 1996; Scott 和 Wilkinson, 1999; Seong 和 Song, 2008; Shen 等, 2016; Zhang 等, 2020; Wang 等, 2024; Wang 等, 2024; Wang 等, 2018; Wang 等, 2018; Zang 等, 2004; Zhang 和 Cao, 2014; Zhu 等, 2001a)

CRediT 作者贡献声明

刘秋实：验证。 潘琪：验证。 邢一婷：验证。 金敬贤：验证。 兰金城：验证。 陈启璐：验证。 李天中：资源、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。 李伟：监督、资源、项目管理。 许多张：撰写——初稿、验证、软件、研究、数据分析、数据整理。 王胜楠：撰写——审阅与编辑、可视化、验证，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32272658）、中国大学科学基金（2025TC006）和中国农业大学 2115 人才发展计划的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有利益冲突。