《Postharvest Biology and Technology》：Bacillus-derived chitosanases as potential antifungal agents for postharvest disease management: Screening, optimization, and functional characterization
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草莓采后真菌病害的生物控制策略研究，发现Bacillus三个菌株（IBA5、IBA7、IBA8）通过分泌chitosanase酶降解真菌细胞壁，抑制Rhizopus oryzae等病原体。经响应面法优化，IBA5酶产量提升92%，其粗提物以8U/果剂量可保持草莓品质。该策略兼具环境友好、经济高效及安全性优势。
Dhanshri Badwaik | Amit Bafana
废弃物与化学毒性评估部门，CSIR-国家环境工程研究所（NEERI），印度马哈拉施特拉邦纳格浦尔440020
摘要
采后生物防治的一个主要挑战是识别具有强拮抗活性的微生物菌株。为了解决这个问题，我们研究了三种Bacillus分离株（IBA5、IBA7和IBA8）对不同采后真菌病原体的拮抗潜力。酶谱分析表明，壳聚糖酶是这三种菌株中的活性抗真菌分子，在pH 5.5和温度50°C时活性最强，并且在广泛的pH范围（5.5–8.5）和温度范围（10–40°C）内保持稳定。TLC分析表明其作用机制为内切壳聚糖酶，而显微镜观察显示壳聚糖酶通过降解Rhizopus oryzae的细胞壁对其孢子和菌丝造成了显著损伤。通过序贯统计优化，壳聚糖酶的产量分别提高了92%（IBA5）、60%（IBA7）和77%（IBA8），这表明它们适用于采后病害控制。使用粗提的Bacillus培养物提取物可以有效减少草莓的真菌腐败，从而避免了繁琐且成本高昂的酶纯化过程，展示了一种直接可扩展且经济有效的策略。每颗水果使用8 U的酶剂量提供了最高程度的保护，同时保持了关键的水果品质属性，包括重量、硬度、pH值、总可溶性固体、滴定酸度和抗氧化活性。所有分离株的非溶血特性证实了它们在采后使用的安全性。此外，壳聚糖酶介导的壳聚糖寡糖的产生表现出抗菌和抗氧化活性，表明了其潜在的二次应用前景。本研究全面展示了Bacillus壳聚糖酶的广谱抗真菌活性，整合了筛选、机制验证、产量优化和实际应用。
引言
像Penicillium、Aspergillus和Fusarium这样的植物病原真菌对全球许多重要作物和水果种类造成了严重损害（Zhao等人，2023年）。2000年至2020年间，水果产量增加了55%，2021年达到9.1亿吨（FAO，2022年，FAO，2023年），但在储存和运输过程中仍有30–50%的水果因真菌腐烂而损失，主要原因是Penicillium expansum（He等人，2019年）和Fusarium属真菌（Peng等人，2022年）。这些采后损失减少了水果的数量和质量，带来了严峻的挑战。此外，植物疾病每年导致全球主要作物的10–15%的损失（Chatterjee等人，2016年），其中70–80%的损失是由真菌引起的（Li等人，2017年）。由于真菌的适应性和杀菌剂的广泛使用，已经出现了抗性菌株，有些甚至成为机会性的人类病原体（González等人，2024年）。常见的植物病原体，如Pythium、Phytophthora、Fusarium和Rhizoctonia，会导致根部和冠部腐烂，而Fusarium、Aspergillus、Penicillium和Alternaria会产生对人类和动物有害的霉菌毒素（Mdee等人，2009年）。目前的化学控制方法只能提供短期缓解，并且常常加速抗性的产生（Li等人，2026年）。这突显了在农业领域迫切需要可持续的广谱抗真菌解决方案。
在这种情况下，植物次生代谢物，如酚类、生物碱和萜类化合物，通过靶向细胞膜和代谢过程提供多种抗真菌作用（Lagrouh等人，2017年），但由于其不稳定性、低可用性和潜在的植物毒性，这些方法的应用受到限制。细菌可以通过产生脂肽、水解酶和抗真菌蛋白来有效抑制真菌生长。真菌细胞壁主要由几丁质组成，在接合菌中含20–50%的壳聚糖（Zamani等人，2007年），例如Absidia、Mucor和Rhizopus；而在子囊菌中，壳聚糖含量为0.3–25%（Barroso-Solares等人，2025年），例如Fusarium属真菌（Azevedo等人，2020年）。真菌壳聚糖可以自然存在，也可以在真菌细胞壁重塑过程中通过酶促脱乙酰化产生。开发能够靶向真菌细胞壁的制剂具有巨大潜力，因为细胞壁对于维持细胞完整性至关重要（Cheng等人，2024年）。主要关注的酶包括降解细胞壁的酶，如壳聚糖酶（CD等人，2021年）、壳聚糖酶（Tomita等人，2013年）、葡聚糖酶（M. Zhao等人，2022年）和蛋白酶（Ling等人，2022年），这些酶可以破坏细胞壁结构，导致真菌细胞裂解。然而，葡聚糖酶和蛋白酶只能针对特定的细胞壁成分（Gow等人，2017年），而壳聚糖酶对脱乙酰化的壳聚糖无效（Mourya等人，2011年）。相比之下，壳聚糖酶专门降解壳聚糖，这是一种在真菌细胞壁中越来越受到关注的聚合物（Thadathil和Velappan，2014年），因此代表了传统抗真菌剂的一种有前景且环保的替代品。
壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）可以促进壳聚糖中β-1,4-糖苷键的水解，壳聚糖是一种通过壳聚糖脱乙酰化获得的聚合物。这一过程产生壳聚糖寡糖（COS）和葡萄糖胺，它们具有多种生物活性，包括抗菌和抗氧化特性。这些酶属于多个糖苷水解酶家族，尤其是GH5、GH8和GH46，其中GH46被研究得最多（Pang等人，2021年）。它们在生物技术和工业领域具有重要意义，主要用于生物活性COS的酶促生产（Aktuganov等人，2025年）。然而，它们作为强效抗真菌剂在食品、农业及相关领域的直接应用仍需进一步探索。
Bacillus是最有前途的生物防治剂之一（Zhou等人，2024年），因为它生长迅速、能够形成内生孢子，并且具有公认的安全性（GRAS）（M. Zhao等人，2022年）。Bacillus物种的广谱抗真菌活性已经得到充分证实，因为它们能够产生脂肽、挥发性有机化合物（VOCs）和裂解酶（Gharsallah等人，2025年；Ghozlani等人，2025年；Malviya等人，2020年）。然而，尽管Bacillus属菌株的壳聚糖酶具有高酶产量、环境稳定性和在生物防治制剂中的有效性等潜在优势（Thi Kim Nguyen等人，2025年），但它们在采后生物防治中的具体作用仍需进一步研究。此外，它们可以与细菌自身的抗真菌代谢物协同作用，实现综合病害管理（Saberi Riseh等人，2024年）。这种协同作用，加上可扩展性和安全性，使Bacillus壳聚糖酶相对于其他细胞壁降解酶具有优势。因此，本研究旨在利用这些特定的酶学特性来增强采后保护，提供一种可持续且有效的化学杀菌剂替代品。
在这项研究中，我们研究了三种产壳聚糖酶的Bacillus菌株（B. velezensis IBA5、B. subtilis IBA7和B. amyloliquefaciens IBA8）对子囊菌和毛霉菌门多种病原真菌的抗真菌潜力。我们采用了一种逐步优化的策略，结合了一次只考虑一个因素的筛选设计和响应面方法来最大化壳聚糖酶的产量。通过实际测试草莓果实，我们确证了壳聚糖酶的生物防治潜力，有效防止了采后腐败。研究中使用了部分纯化的酶制剂，以解决与酶应用相关的经济限制。据我们所知，这是首次将Bacillus中的组成型广谱抗真菌壳聚糖酶生产与统计产量优化和粗提物的直接应用相结合的研究。这些发现为开发环境友好的真菌病害管理策略带来了重要进展。
部分内容
细菌和真菌菌株的分离
已知生物气溶胶微生物组是真菌病原体的关键传播途径，也是发现细菌拮抗剂的重要来源（Fr?hlich-Nowoisky等人，2009年）。因此，我们在印度纳格浦尔的多个地点被动采样了环境中的生物气溶胶，将琼脂平板暴露2小时以捕获空气中的微生物。经过培养后，分别在营养琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂上分离出了多种细菌和真菌，并进行了纯化
交叉划线和琼脂塞实验
使用交叉划线实验初步筛选出了40个细菌分离株中的5个具有明显的抗真菌活性。由于这种方法只能提供定性结果，因此采用了半定量琼脂塞实验来测量裂解区。三个分离株IBA5、IBA7和IBA8对所有五种测试的真菌都显示出了明显的抗真菌作用（图1A，i-v），其中IBA5的活性最强（图1B）。这些实验使得快速识别出强效的抗真菌菌株成为可能
结论
本研究强调了Bacillus来源的壳聚糖酶，特别是B. velezensis IBA5中的壳聚糖酶，作为抑制采后真菌腐烂的有效且安全的生物防治剂。粗提的壳聚糖酶制剂通过抑制Rhizopus oryzae并保持草莓果实的质量，提供了与健康对照组相当的保护效果。此外，壳聚糖酶生成的壳聚糖寡糖还表现出额外的抗菌和抗氧化活性，揭示了其双重作用机制
CRediT作者贡献声明
Dhanshri Badwaik：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法论、数据分析、概念化。Amit Bafana：撰写——审稿与编辑、监督、软件使用、资源管理、项目协调、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系。Dhanshri Badwaik报告称获得了印度科学与工业研究委员会-大学拨款委员会（University Grants Commission）的财政支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
Dhanshri Badwaik感谢印度科学与工业研究委员会-大学拨款委员会（Council of Scientific & Industrial Research-University Grant Commission）提供的初级研究奖学金（奖励函编号：809/(CSIR-UGC NET JUNE 2019）。该手稿使用iThenticate软件进行了抄袭检查，并记录在纳格浦尔CSIR-NEERI的知识资源中心（KRC编号：CSIR-NEERI/KRC/2025/OCT/WCTA/1）中以进行防抄袭验证。
