《Sensors and Actuators B: Chemical》：Spectral-interference-minimal MAFs@AuNPs-mediated dual-readout lateral flow immunoassay for clenbuterol ultrasensitive detection
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本研究开发了一种基于金属-聚集诱导发光框架（MAFs）与金纳米粒子（AuNPs）复合的纳米杂交探针，通过静电自组装实现MAFs表面均匀负载AuNPs。该探针在双读出检测中消除荧光淬灭，保留78.6%荧光量子产率，同时增强AuNPs比色信号2倍。构建的竞争式双读出LFIA对CLB检测线性范围扩展41倍（0.01-3.90 ng/mL），检测限达0.007 ng/mL，验证了在真实样品中与LC-MS/MS高度一致性和87.5-108.3%加标回收率，为食品供应链中高效、经济的兽药残留快速筛查与精准检测提供新方案。
钱然|孙博彦|王晓梅|任江康|刘楚军|王琪琪|刘子莫|沈建忠|熊金成|姜海阳
中国农业大学兽医学院兽医药理学与毒理学系，农业农村部兽医公共卫生与安全国家重点实验室、兽药残留与非法添加剂检测重点实验室，北京 100193，中国
摘要
在畜牧业中非法使用克仑特罗（CLB）对公共卫生构成重大风险，因此需要灵敏可靠的检测方法。传统的基于金纳米粒子的侧向流动免疫测定（AuNPs-LFIAs）通常受到灵敏度有限和动态范围狭窄的困扰。在这里，我们通过将AuNPs静电整合到金属-活性发光剂框架（MAFs）中，开发了一种双读数纳米杂交探针。MAFs的固有荧光（激发波长≈350 nm，发射波长≈475 nm）与AuNP的吸收波长（≈520 nm）之间的光谱重叠最小，从而保留了MAFs 78.6%的量子产率，并实现了比传统AuNPs-LFIAs高2倍的比色吸光度增强。这种探针将明亮的荧光和强烈的比色信号结合到一个坚固的LFIA试纸上。对于CLB的检测，所构建的双读数LFIA实现了超宽的线性范围（0.01–3.90 ng/mL）和显著提高的检测限（0.007 ng/mL），其线性范围比传统AuNPs-LFIAs宽41倍。该方法在添加了CLB的猪尿和猪肉样本中表现出令人满意的回收率（87.5–108.3%），并且在应用于实际样本时与高效液相色谱-串联质谱的结果高度一致。这项工作提出了一种通用的设计原理，用于开发光谱干扰最小的双读数探针，推动了LFIA技术的发展，使其具有高灵敏度、超宽的动态范围和可靠的性能，适用于从农场到餐桌的现场监测。
引言
食品安全是公共卫生的基石和社会经济可持续发展的基础。在畜牧业中非法使用β2-肾上腺素能激动剂（如克仑特罗（CLB）已成为全球性的食品安全问题[1]。CLB可以促进瘦肉生长，但食用含有CLB的产品可能导致严重的健康问题，包括神经系统、心血管系统和内分泌系统的损害，表现为心悸、肌肉震颤和器官损伤[2]。各国对食品中的CLB残留物有严格的监管。食品法典委员会设定的限值为0.2 μg/kg[3]；而中国、美国和欧盟则实施了零容忍政策[4],[5],[6]。为了确认检测，中国采用了高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），其检测限（LOD）为0.5 μg/kg[7]。目前CLB的检测主要依赖于LC-MS/MS和气相色谱-质谱等仪器方法，尽管这些方法非常准确，但需要繁琐的样品预处理、昂贵的仪器和受过培训的人员，这限制了它们在实时、大规模“从农场到餐桌”监测中的实用性，尤其是在新的污染事件发生时[8],[9],[10],[11],[12]。为了有效控制CLB，检测策略必须覆盖整个供应链，能够在农场和屠宰场进行灵敏的终端验证和快速的现场筛查。这需要灵活的分析工具，以适应不同的基质、变化的残留限和多阶段的监管需求。侧向流动免疫测定（LFIA）是一种基于特异性抗原-抗体结合的即时检测方法，由于其简单性、低成本和便携性，在临床诊断、环境监测和食品安全中得到广泛应用[13],[14],[15],[16],[17]。然而，传统的基于金纳米粒子的LFIA（AuNPs-LFIA）通常灵敏度有限，视觉解释为半定量，并且容易受到基质干扰，特别是在复杂的生物样本中会导致假阴性[18]。为了满足“现场快速初步筛查”和“实验室精确定量”在CLB控制中的双重要求，理想的解决方案是开发一种结合视觉读数能力和高灵敏度定量功能的双读数LFIA。荧光LFIA（FLFIA）提供了一个有前景的解决方案，因为它提供了更高的灵敏度并支持定量分析[19]。然而，常用的有机荧光染料、量子点和稀土荧光材料会受到聚集引起的荧光淬灭（ACQ）的影响，这限制了纳米探针的荧光亮度和LFIA的检测灵敏度[20],[21]。因此，需要具有优异光物理性质和胶体稳定性的新型荧光探针来提升FLFIA的性能。金属-活性发光剂框架（MAFs）由聚集诱导发光剂（AIEgens）和金属离子构成，为这些挑战提供了有希望的解决方案。这些框架具有明亮的荧光、高量子产率和出色的胶体稳定性，即使在复杂的样品基质中也是如此[22]。它们的多孔结构提供了较大的表面积和多样的功能化能力，有利于探针的装载和生物识别。已有报道将MAFs应用于大分子的夹心格式LFIA中[23]。然而，关于它们在通常用于小分子检测的竞争格式中的性能和优化研究仍然不足。这种格式的核心挑战在于平衡信号强度和竞争性抑制效率。在这项研究中，以CLB为模型，我们系统地研究了MAFs@AuNPs探针在竞争性LFIA中的构建和调制。
此外，仅依赖单一信号模式无法满足从农场到餐桌的CLB监测的严格要求，因为微量污染需要多阶段的验证以做出可靠的决策。比色-荧光双读数传感技术通过将这两种模式整合到一个平台上解决了这个问题。这种策略弥补了每种模式本身的局限性，同时协同利用了它们的优势，包括荧光的高灵敏度用于微量定量和比色的半定量视觉现场验证能力[24],[25],[26],[27]。尽管双读数LFIA系统在概念上具有优势，但受到三个关键挑战的制约：(i) 复杂且耗时的探针合成容易引入杂质；(ii) 比色和荧光报告剂之间的显著光谱重叠导致信号衰减；(iii) 高材料成本（例如，掺杂稀土的荧光粉、基于重金属的量子点）阻碍了大规模应用。这些问题构成了实际双读数免疫测定发展的主要瓶颈。迫切需要通过材料创新和简化策略来开发新型、更高效、稳定和经济的探针。
在这里，我们介绍了一种最小化光谱干扰的策略，用于制造结合视觉比色和超亮荧光的MAFs@AuNPs，并进一步应用于CLB监测的双读数LFIA（图1）。该策略首先通过一步水热合成超亮、高蓝光发射的MAFs，然后使用聚乙烯亚胺（PEI）进行表面功能化以赋予正电荷，并通过静电自组装将AuNPs均匀加载到MAFs支架上。关键的是，MAFs的激发（约350 nm）和发射（约475 nm）光谱与AuNPs的吸收（约520 nm）之间的光谱重叠可以忽略不计，有效地最大程度地消除了MAFs和AuNPs之间的荧光淬灭，同时实现了78.6%的荧光保留和AuNP吸光度增加2倍。此外，静电自组装策略允许AuNPs快速均匀地整合到多孔的MAF载体上，提供了高的抗体装载能力，同时简化了探针的构建。当应用于竞争性LFIA时，MAFs@AuNPs-LFIA实现了线性范围（0.01–3.90 ng/mL）扩大41倍，LOD达到超低水平（0.007 ng/mL），超过了传统AuNPs-LFIA。结合荧光定量实现微量灵敏度和超宽动态范围，以及基于AuNPs的强比色可视化进行快速现场筛查，提供了一种整合的解决方案，满足了从农场到餐桌的监测需求。总体而言，所提出的无光谱干扰的MAFs@AuNPs-LFIA为下一代双读数免疫测定提供了一个通用的设计原理，提供了一种成本效益高、可扩展且灵活的工具，适用于CLB监测以及食品供应链中其他小分子污染物的检测。
材料与化学品
牛血清白蛋白（BSA）从Sigma-Aldrich, Inc.（美国密苏里州圣路易斯）购买。氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸钠、ZrCl4、1,1,2,2-四（4-羧基苯基）乙烯（TCPE）、PEI（10 kDa）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）从上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）获得。N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、蔗糖、海藻糖、乙醇、甲醇、乙腈、Tween-20、NaCl、HCl、NaOH和K2CO3由国药化学试剂有限公司提供，
MAFs和MAFs@AuNPs的制备和表征结果
提出了一种最小化光谱干扰的双读数探针制备策略，其制备流程如图1a所示。首先通过一步水热反应合成MAFs，然后进行PEI表面功能化以赋予正电荷，最后通过静电自组装将AuNPs均匀吸附到MAFs表面。ζ电位分析确认原始MAFs带有负电荷，而PEI处理后电荷被反转
结论
总结来说，我们提出了一种新的最小化光谱干扰的策略来制造MAFs@AuNPs，并将其整合到LFIA中，用于CLB的灵敏和双读数检测。这项工作的关键创新在于合理设计的组装策略，该策略利用了MAFs的固有荧光，同时保持了与AuNP吸收峰约45 nm的光谱分离，有效地消除了荧光淬灭，避免了对外部荧光团的依赖。
CRediT作者贡献声明
钱然：撰写——原始草稿、方法学、数据管理。
孙博彦：研究、验证、撰写——审阅与编辑。
王晓梅：验证、形式分析。
任江康：数据管理。
刘楚军：数据管理。
王琪琪：数据管理。
刘子莫：数据管理。
沈建忠：数据管理。
熊金成：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。
姜海阳：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32373096）、CPSF的博士后奖学金计划（B级：GZB20240291）以及中国博士后科学基金（编号：2025T180819、2024M761309）的支持。
钱然目前是中国农业大学的硕士生。她的研究兴趣在于基于聚集诱导发光的MOFs构建侧向流动免疫测定方法，用于检测兽药残留物。
