多孔N、C共掺杂的Co?O?纳米酶具有高效的类氧化酶活性，可用于磷酸镁抗坏血酸的比色检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Porous N, C co-doped Co 3O 4 nanozyme with efficient oxidase-like activity for colorimetric detection of magnesium ascorbyl phosphate

纳米酶催化性能提升策略及其在化妆品检测中的应用研究。采用卵清蛋白（OVA）作为模板和氮碳源，通过低温煅烧在MOF中引入多孔结构，协同增强表面积和电子转移效率，制备的N/C-Co3O4纳米酶氧化酶活性显著提高，检测限达0.36 μM，成功构建化妆品中镁Ascorbyl磷酸检测平台。

　　

曾远伟|秦媛|胡晓曦|黄远林|王胜娥|赵树林|叶芳桂

中国教育部药用资源化学与分子工程重点实验室，广西药用资源化学与分子工程重点实验室，广西师范大学特色药用资源化学工程研究中心，化学与药学学院，桂林541004，中华人民共和国

摘要

由于纳米酶具有类似酶的催化活性和纳米材料的独特性质，它们已被广泛应用于生物传感领域。纳米酶的活性是影响传感器性能的关键因素，包括检测灵敏度和分析时间。因此，开发新的策略来有效提高纳米酶的催化性能备受期待。本研究以Co₃O₄纳米酶为例，使用低成本的无酶卵白蛋白（OVA）作为模板，在金属有机框架中生成额外的孔结构，从而增加表面积并加速质量传递速率。同时，OVA既作为氮源也作为碳源，促进电子转移并进一步调节纳米酶的活性。基于上述策略，成功合成了一种具有高效氧化酶活性的N/C-Co₃O₄纳米酶，并将其应用于抗坏血酸磷酸镁的比色检测中。所开发的传感系统在0.50至70?μM的浓度范围内表现出线性响应，计算出的检测限为0.36?μM。这些结果展示了通过整合多种方法策略来调节纳米酶活性的创新方法。

引言

纳米酶是具有类似酶活性的纳米材料，结合了纳米系统和天然催化的特性，可用于生物传感、癌症治疗和环境修复[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。在过去二十年里，金属氧化物纳米酶（MON）由于其出色的物理化学性质、低成本、高稳定性和易于储存而得到了快速发展[6]、[7]。常见的MON如CeO₂、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₃O₄、Mn₂O₃和Mn₃O₄已被报道具有氧化酶（OXD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，同时还表现出磁性、荧光和介电等独特性质[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。然而，MON的催化效率仍低于天然酶。调节其活性是该领域的一个前沿热点。探索新的活性调节策略是扩大其应用范围的有效途径[14]、[15]、[16]、[17]。

目前调节MON活性的策略包括形态控制、尺寸调整、表面修饰和元素掺杂等[18]、[19]、[20]。这些方法主要通过改变比表面积、表面电荷和电子结构来调节活性。先前的研究表明，随着比表面积的增加，催化性能得到提升。例如，Singh等人[21]比较了不同形态的Mn₃O₄纳米颗粒的酶活性，发现花状纳米颗粒的比表面积大于立方形、多面体、六边形板和板状纳米颗粒，因此产生了更高的催化活性。此外，掺入金属离子可以创建额外的活性中心，从而有效地促进与底物的电子交换，显著加快纳米酶在催化循环中的电子转移速率。2025年，Chen等人[22]通过掺锰的Co₃O₄薄膜增强了类氧化酶活性，用于L-半胱氨酸的比色测定。Wen等人[23]通过掺钌的Co₃O₄提高了类氧化酶活性，用于多巴胺的比色传感。值得注意的是，非金属掺杂可以引入额外的载流子，增强电子导电性并加速催化反应。例如，Ma等人[24]通过引入不同的非金属原子（N、P、S和B）合成了具有良好类POD活性的铁基氧化物纳米酶，并设计了硼掺杂的铁基氧化物纳米酶，用于AChE-ChOx-POD三酶级联比色生物传感，以检测AChE活性和抑制剂。显然，增加比表面积和元素掺杂都是提高MON活性的有效方法。虽然表面面积优化和掺杂都能有效增强MON活性，但结合这两种策略仍然具有挑战性。

生物大分子-金属有机框架（BMOF）是一类先进的混合复合材料，通过将生物大分子（如酶、蛋白质、DNA和多糖）整合到MOF中构建[25]、[26]。以往的研究主要集中在保持封装生物大分子的生物活性上，往往忽视了它们的整体材料性质。BMOF为调节材料结构和性质提供了一种新颖且可持续的策略。生物大分子的独特分子结构使它们能够在热解过程中作为有效的掺杂剂和孔形成模板。一方面，它们富含氮和碳等元素，可以通过热解引入材料晶格中，实现异原子掺杂。这调整了材料的电子云分布和能带结构，从而增强了其电导率[27]。另一方面，在热解过程中，生物大分子释放气体并分解，从而实现原位孔形成并抑制颗粒聚集。这导致了丰富的层次孔结构，显著增加了比表面积。基于此，我们提出了一种生物大分子辅助煅烧策略，同时利用生物大分子作为掺杂源和结构导向剂。这种方法将“掺杂效应”和“结构调节”结合在一步中，为构建具有高比表面积和优异电子传输能力的催化材料提供了有希望的途径。此外，作为多孔混合材料的MOF具有固有的优势，包括高比表面积和可调的孔隙率[28]。从MOF前驱体热解得到的MON材料不仅保留了MOF的优势，还表现出更好的稳定性[29]、[30]。

在这项工作中，作为概念验证，我们使用卵白蛋白（OVA）和ZIF-67作为前驱体，通过一步合成法制备了高比表面积的N/C-Co₃O₄，随后进行低温热解。在这种策略中，OVA既作为牺牲模板创建孔结构，也作为氮和碳元素的来源，以增强电子转移。这种组合方法使得N/C-Co₃O₄的氧化酶活性显著提高。此外，在本研究中，通过结合N/C-Co₃O₄纳米酶和酸性磷酸酶（ACP）级联反应，将化妆品中的抗坏血酸磷酸镁（MAP）转化为抗坏血酸（AA），并构建了一步比色检测平台，检测原理如图1所示。这项工作为化妆品的质量监督提供了一定的技术支持。该研究详细探讨了这种策略所实现的比表面积增加和电荷转移加速之间的协同机制，并系统评估了类似酶活性的增强效果。这不仅为开发高性能催化剂提供了一种简单绿色的合成途径，还为材料的结构-电子性质-催化性能关系提供了重要见解。

试剂和仪器

所有试剂和仪器详见支持信息。

N/C-Co₃O₄的类氧化酶活性

需要样品制备程序。通过比色法研究了N/C-Co₃O₄型氧化酶的活性。在氧气存在下，N/C-Co₃O₄催化TMB的氧化，产生大约650?nm处的特征吸收信号。简单来说，将N/C-Co₃O₄（100?μL，1?mg/mL）和TMB（50?μL，10?mM）混合在预先加入850?μL缓冲液（0.1?M HAc-NaAc）的离心管中，振荡混合

N/C-Co₃O₄的特性

高类氧化酶活性的N/C-Co₃O₄是通过后合成热解方法制备的，具体的合成路线如图1所示。首先，使用硝酸钴六水合物和2-甲基咪唑作为原料合成前驱体，以生物大分子作为氮和碳的来源。随后，通过低温热解处理获得N/C-Co₃O₄。多种表征技术确认了N/C-Co₃O₄的成功合成。高分辨率透射

结论

总之，开发了一种具有高氧化酶活性的多孔氮碳共掺杂Co₃O₄纳米酶。基于增加比表面积和通过元素掺杂调节纳米酶活性，开发了一种新策略。使用OVA作为牺牲模板，在MOF中引入额外的孔结构以增强比表面积。同时，OVA既作为氮源也作为碳源，促进电子转移。构建了一个传感平台

CRediT作者贡献声明

曾远伟：概念构思、方法设计、初稿撰写。 秦媛：研究调查和数据管理。 胡晓曦：验证。 黄远林：数据管理。 王胜娥：概念构思、资金获取。 赵树林：项目管理。 叶芳桂：概念构思、资金获取、撰写-审稿与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22464005）和国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点项目（编号U23A20686）的支持。