在氧化应激条件下，利用高度互补的双信号合金探针对细胞内活性氧（ROS）的变化进行无创监测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Non-invasive monitoring of intracellular ROS variations by highly complementary dual signal alloy probes under oxidative stress

动态监测细胞内活性氧的合金型CD/Raman探针研究

　　

Xianyang Li|Xuchen Du|Xianling Piao|Chunzhi Cui|Xian Wu Cheng

中国吉林省延吉市延边大学实验化学教育国家级示范中心化学系，邮编133002

摘要

在外部氧化应激作用下，简单有效地监测细胞内活性氧（ROS）的变化在生物医学领域非常重要。然而，监测ROS的变化面临许多挑战。需要同时考虑整个细胞群体和单个细胞，并且要能够长时间动态监测。此外，一个非常重要的因素是监测过程本身可能产生的额外ROS。基于这些考虑，本研究设计并制备了一种兼具圆二色性（CD）和拉曼信号的合金型探针。当细胞受到氧化应激时，探针表面的银元素螺旋条纹会被生成的ROS侵蚀，导致探针的CD和拉曼信号同时减弱。通过CD和拉曼分别可以监测宏观细胞群体和单个细胞中的ROS变化。值得注意的是，基于该探针的监测过程完全避免了可能由激发光引起的额外ROS的产生。本研究提出的策略改进了监测细胞内ROS变化的方法，并为未来探针材料的设计提供了指导框架。

引言

氧化应激可导致多种疾病，如癌症、神经退行性疾病和心血管疾病[1]、[2]。其内在原因是氧化应激会导致细胞内活性氧（ROS）水平异常升高，从而引发一系列事件，包括脂质过氧化、蛋白质变性以及脱氧核糖核酸（DNA）损伤[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。因此，对由氧化应激引起的ROS动态变化进行长期精确监测受到了重视[8]。传统的ROS监测技术，如电子自旋共振（ESR），通常存在灵敏度低、操作耗时以及样品制备复杂等局限性[9]、[10]。

近年来，包括电化学传感器[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、荧光探针[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]以及表面增强拉曼光谱（SERS）[25]、[26]、[27]、[28]等新兴技术逐渐得到发展。尽管这些技术在灵敏度上有所提高，但仍面临一些挑战，如动态监测能力不足、单一信号导致的准确性较低，以及需要进一步优化才能应用于实际场景[29]、[30]。

最近，双信号协同监测因其独特优势而受到广泛关注，成为ROS监测的研究热点[31]、[32]。与单信号相比，双信号策略通过结合各自的优势并实现交叉验证，提高了准确性、可靠性和减少了假阳性结果，从而增强了结果的稳健性[33]、[34]、[35]。例如，已有报道了“拉曼+荧光”[36]或“光声+荧光”[37]的组合。

然而，双信号策略不能仅局限于简单的“1+1”信号叠加模式。需要评估这两种信号之间的互补性，并对其在实际应用中的通用性和操作简便性进行全面评估[38]。此外，由于涉及对氧化应激引起的细胞内ROS变化的动态监测，必须排除监测过程本身可能引入的额外氧化应激。然而，许多研究人员忽视了这一点[39]。

为了解决这些关键问题，本研究制备了一种基于等离子体合金的纳米探针，其中添加了半胱氨酸（Cys）以产生圆二色性（CD）信号，并使用4-巯基苯腈（4-MBN）作为拉曼报告分子。这种组合有望实现良好的互补性，从而在复杂的生物环境中实现更可靠和稳健的ROS监测。据我们所知，尚未有报道结合这两种信号的探针[40]、[41]。由于合金探针的纳米结构产生的局域表面等离子体共振（LSPR）效应，即使使用低激发能量也能获得显著增强的CD和拉曼信号。这可以确保对生物样本的非侵入性监测[42]、[43]。此外，还可以避免在长期动态监测过程中产生额外的ROS[44]。

考虑到仪器的特性，该探针还具有以下优势：首先，在空间尺度上，拉曼只能监测单个细胞内的ROS变化，而CD信号可以反映宏观细胞群体的情况；其次，拉曼信号可以利用细胞安静区域（1800–2800 cm^-1）的特征峰来补偿CD信号的弱度，该区域不易受到生物基质或pH变化的干扰，并且不受H₂O分子的干扰[52]。

氧化应激引起的ROS会逐渐侵蚀合金探针表面的螺旋条纹，从而影响LSPR效应，降低CD和拉曼信号，从而实现ROS的动态监测，如图1所示。本研究提出的具有CD/Raman双信号的合金探针突破了传统的“1+1”模式框架，强调了双信号探针概念的重要性，并在氧化应激引起的细胞内ROS动态监测中展示了良好的效果。这为未来的多信号探针设计提出了更高的要求，也为相关设计概念提供了参考。

材料

四氯金(III)酸氢盐四水合物（HAuCl₄·4H₂O，99.99%）、硝酸银（AgNO₃，99%）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，99%）、硼氢化钠（NaBH₄，99.99%）、L-抗坏血酸（L-AA，99%）、正硅酸四乙酯（TEOS，99.5%）和4-(甲基硫)苯腈（4-MBN，98%）均购自Sigma-Aldrich公司。L-半胱氨酸（L-Cys，99%）、D-半胱氨酸（D-Cys，98%）、油酸钠（NaOL，98%）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，99%）购自Innochem公司。氢氧化钠（NaOH）...

结果与讨论

如图1（a）所示，Cys和4-MBN分子通过共价键同时修饰在金纳米棒表面。其中，Cys分子的类型（L-型或D-型）决定了螺旋等离子体纳米棒（HPNRs）的手性特性。通过在金纳米棒上生长含微量Au的Ag合金壳层来制备HPNRs，因为掺入Au可以提高材料的稳定性并保持其优异的等离子体特性[53]。见图1（b）和（c）

结论

本研究开发了一种具有极高互补性的合金型CD/Raman探针。由于其合理设计的热点结构，即使在低激发能量下也能获得清晰的信号。ROS会侵蚀合金探针表面的Ag元素，导致热点结构破坏，从而使CD和拉曼信号减弱。这些探针能够在细胞受到外部氧化应激时实现细胞内ROS水平的长期动态监测。

作者贡献声明

Xianyang Li和Xuchen Du对这项工作做出了同等贡献。

Xianyang Li：数据整理、形式分析、研究、方法论、初稿撰写。Xuchen Du：概念构思、研究、方法论、初稿撰写。Xianling Piao：概念构思、研究（形态学和光学分析）、监督、初稿撰写。Chunzhi Cui：概念构思、形式分析、项目管理、监督、审稿与编辑。Xian Wu Cheng:

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了吉林省科学技术厅（资助编号：20240101160JC、YDZJ202601ZYTS735）、吉林省长白人才优秀团队基金会（编号：20240717129）以及高等教育学科创新项目（编号：D18012）的支持。