《South African Journal of Botany》：Functional annotation and expression analysis of cytochrome P450 monooxygenases in differential sennoside producing tissues of
Senna alexandrina Mill.
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CYP450酶在Senna alexandrina中sennosides生物合成中的作用研究：通过生物信息学分析鉴定34个CYP基因，结合HPLC和qPCR发现叶片中12个CYP基因高表达，分子对接显示SaCYP1、18、21、28、33与anthraquinone结合力最强，为解析sennosides合成通路提供依据。
Mushfa Khatoon | Amita Dubey
遗传工程与转化生物学实验室，跨学科研究卓越中心（ICEIR），生物科学系，Integral大学，Kursi路，勒克瑙226026，印度
摘要
细胞色素P450单加氧酶（CYPs）是最大的酶超家族之一，在植物次生代谢物的生物合成中起着核心作用。在Senna alexandrina Mill.中，主要的生物活性代谢物是番泻苷，它们具有广泛的药理活性。在这项研究中，我们旨在鉴定参与番泻苷生物合成的CYP超家族候选成员。从公开可用的转录组数据库中检索到了S. alexandrina的34个CYP基因（SaCYPs），并根据系统发育分析将其分为6个族和23个家族。所有鉴定出的SaCYPs都具有CYP超家族的特征保守结构域以及底物识别位点（SRS）。使用在线预测工具in silico预测了SaCYPs的亚细胞定位。S. alexandrina不同组织的HPLC分析显示，叶片中的番泻苷积累量高于根和茎。通过定量PCR（qPCR）分析了产生不同番泻苷含量的组织中的SaCYP基因表达水平。结果表明，在34个SaCYP中，有12个在叶片组织中表达量较高。为了进一步评估SaCYPs在番泻苷生物合成中的功能相关性，进行了分子对接研究，结果显示SaCYP1、SaCYP18、SaCYP21、SaCYP28和SaCYP33与番泻苷中间体（蒽醌）的结合亲和力最高。因此，本研究重点关注了S. alexandrina中细胞色素P450单加氧酶的生物信息学和基因表达分析，以阐明其在番泻苷生物合成途径中的潜在作用。
引言
细胞色素P450单加氧酶（CYPs）是一类含有血红素基团的血红素-硫醇氧化还原酶超家族。CYPs存在于所有生物界中，包括病毒、细菌、古菌、真菌、原生生物、植物和动物。它们在多种代谢过程中发挥着关键作用，迄今为止已鉴定出超过300,000个CYP基因。其中约16,000个是植物特异性的，这突显了它们在植物生理、代谢和适应中的重要性（Lamb等人，2019；Nelson，2018；Xu等人，2015）。植物CYPs具有广泛的催化能力，在植物中多种化学代谢物的生物合成中起着至关重要的作用。这些酶催化了形成结构复杂的次生代谢物的关键反应，这些代谢物通过各种氧化和修饰反应参与植物的防御和环境相互作用。因此，植物CYPs已成为当前植物代谢和功能基因组学研究的主要焦点（Hansen等人，2021；Mizutani和Ohta，2010）。
CYPs在参与植物防御、信号传导、耐逆性和适应不同环境的次生代谢物的生物合成中起着重要作用（Hansen等人，2021；Misra等人，2012；Mokhosoev等人，2024）。各种植物中存在的植物特异性CYPs支持了独特次生代谢物的产生，构成了植物可塑性的基础。与微生物和动物相比，植物CYPome（特定物种中发现的CYP总数）更大（Hansen等人，2021）。植物CYPs合成了多种初级和次级代谢物，包括萜类、苯丙素类、生物碱、多元醇、植物激素、氰苷等（Werck-Reichhart，2023）。CYPs根据其氨基酸序列的相似性被分类为不同的家族和亚家族。在植物中，不同的CYP家族与特定的生化功能相关。CYP71和CYP72家族的成员主要参与萜类、苯丙素类和生物碱等特殊代谢物的生物合成和修饰，而CYP97家族成员参与类胡萝卜素和叶黄素的生物合成。其他CYP家族如CYP88和CYP707则分别以其在赤霉素和脱落酸代谢中的作用而闻名。因此，将CYPs分类为不同的家族和亚家族为基于与先前鉴定的植物CYPs的同源性预测其潜在代谢功能提供了有用的框架（Bak等人，2011；Nelson等人，2004；Werck-Reichhart，2023）。植物CYPs被分为10个族，其中CYP71、CYP85、CYP72和CYP86包含多个家族，而CYP51、CYP97、CYP74、CYP710、CYP727和CYP711各自仅代表一个家族（Nelson等人，2004）。CYP51家族在修饰甾醇前体和三萜类方面起着关键作用。CYP71族的成员参与多种化合物的生物合成，包括萜类、黄酮类、生物碱和氰基氨基酸。CYP85族主要参与萜类的生物合成，而CYP72和CYP86族主要参与与脂肪酸和萜类生物合成相关的反应（Wang等人，2024）。
Senna alexandrina Mill.（通常称为番泻）是一种备受推崇的豆科药用植物，传统上以其作为泻药而在民间医学中使用（Kumar等人，2022）。除了其通便作用外，该植物还具有多种药用价值，包括作为祛痰剂、护肝剂、抗糖尿病和抗痢疾药物（AL-adhal，2009；Bellassoued等人，2021；Dubey等人，2022）。由于其价格实惠和有效性，番泻被认为是最受欢迎的蒽醌类泻药之一（Ulbricht等人，2011）。该植物的通便作用主要归因于其活性化合物，如芦荟素、番泻苷和丹蒽酮苷，这些都是蒽醌衍生物和苷类（Monkheang等人，2011）。番泻的豆荚和叶子中发现的蒽醌苷，特别是番泻苷A和B，是蒽醌的衍生物。番泻含有四种主要类型的番泻苷——A、B、C和D，其中番泻苷A和B约占其药理作用的80%（Stuppner和Sturm，1996）。虽然番泻苷的化学结构和药理作用已经得到充分研究，但其生物合成途径仍不完全清楚，蒽醌生物合成之后的步骤仍有待探索。番泻苷的母分子是蒽醌，已在多种植物中进行了研究。据报道，在植物中，蒽醌的生物合成通过MEP、MVA、多酮途径以及Shikimate途径发生。然而，最近的研究确定多酮途径是提供蒽醌生物合成前体的主要途径（Kang等人，2020；Rama Reddy等人，2015；Thaker等人，2024）。因此，番泻苷生物合成的骨架和前体也认为来源于这些途径（图1）。
据报道，细胞色素P450单加氧酶（CYPs）参与了多种次生代谢物的生物合成，并且还预测它们可以催化蒽醌转化为更高氧化程度的中间体（Rama Reddy等人，2015）。尽管有这些预测，但由于尚未明确鉴定或研究S. alexandrina中参与番泻苷生物合成的CYP酶，我们对这一途径的理解仍然有限。解决这一空白对于更好地理解生物合成途径以及开发提高番泻苷产量的策略非常重要。本研究旨在阐明CYPs在Senna alexandrina中参与番泻苷生物合成的潜在作用。为此，使用生物信息学工具从公共数据库中鉴定和分离CYP基因。然后进行了分子对接分析，以预测对蒽醌（番泻苷的主要前体）具有较高结合亲和力的CYPs。最后，将对接结果与不同番泻苷产生组织中的CYP基因表达谱相关联，建立了CYP活性与番泻苷生物合成之间的联系。通过将计算分析与表达分析相结合，本研究为鉴定可能在S. alexandrina中参与番泻苷生物合成的关键CYP基因候选者提供了起点。
部分摘录
从公共数据库中检索细胞色素P450单加氧酶基因
从公开可用的转录组霰弹枪组装（TSA）数据库中检索了S. alexandrina的细胞色素P450单加氧酶（CYP）基因序列。使用其他豆科植物（如Glycine max、Cicer arietinum等）的已知CYP序列作为查询，对S. alexandrina的TSA数据库进行了BLAST分析。保留了统计上显著相似性的BLAST结果，E值截止值为≤1e?5。
检索S. alexandrina的细胞色素P450单加氧酶基因
在S. alexandrina的转录组霰弹枪组装（TSA）数据库中搜索CYP基因序列。经过筛选，共鉴定出34个CYP基因，并根据从转录组数据库中检索的顺序将其命名为< />至< />（访问号GCZV00000000和GCVR00000000）。根据预测的开放阅读框（ORF）长度以及保守的CYP特征基序的存在与否，24个SaCYP被分类为全长基因。
讨论
细胞色素P450单加氧酶具有多种功能，既促进植物生长发育，也参与天然产物的生物合成。因此，本研究旨在总结S. alexandrina的CYP基因，以便探索其在番泻苷生物合成中的作用。在这项研究中，我们对S. alexandrina的孤立SaCYPs进行了全面的生物信息学和实时表达分析，并估计了不同组织中的番泻苷含量。
结论
细胞色素P450单加氧酶（CYPs）在植物次生代谢物的生物合成和多样化中起着关键作用；然而，它们在Senna alexandrina中的具体功能，特别是参与番泻苷生物合成的功能尚不完全清楚。因此，在本研究中，我们利用公开可用的转录组数据集对S. alexandrina中的CYPs进行了全面分析，重点关注它们的系统发育关系、保守基序和基因表达谱。
数据可用性
本研究分析的数据集包含在本手稿以及补充信息文件中。
财务支持
作者感谢印度政府科学技术部Start Up Research Grant（SRG）、Science and Engineering Research Board（SERB）为Amita Dubey博士提供的财务支持，资助编号为SRG/2021/001248。
CRediT作者贡献声明
Mushfa Khatoon：写作——审稿与编辑，撰写——初稿，方法学，正式分析。Amita Dubey：写作——审稿与编辑，验证，监督，正式分析，概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢Integral大学（MCN编号IU/R&D/2025-MCN0003613）和DST-FIST（SR/FST/LS-1/2017/13-C）为进行这项研究工作提供的基础设施。
