《Talanta》：Homogeneous electrochemical sensor for sensitive detection of HBV DNA based on magnetic separation and CRISPR/Cas12a protein
trans-cleavage
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快速高灵敏HBV DNA检测的电化学传感器研究，通过CRISPR/Cas12a靶向识别与磁珠分离技术，实现10 fM-10 nM检测范围，3.74 fM检测限，适用于资源有限地区的临床诊断。
杨明琦|胡佳丽|张振林|黄丽婷|余雅涵|邱德星|祖业欣|刘艳艳|林振宇
澳门科技大学医学院，中国澳门塔ipa，999078
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）感染对全球健康构成了重大挑战，尤其是在医疗基础设施不足的地区，快速和现场检测在有效疾病管理和控制中起着关键作用。因此，有必要开发一些简单但灵敏的HBV筛查技术。在这项工作中，我们构建了一种均相电化学生物传感器，通过整合CRISPR/Cas12a目标识别和基于磁珠的分离技术，实现了对HBV DNA的灵敏和特异性检测。该传感器利用CRISPR/Cas12a蛋白在识别目标双链DNA时的附带切割活性，从而降解捕获在磁珠（MBs）上的亚甲蓝标记的单链DNA。然后分离磁珠并重新溶解在溶液中，可以在均相溶液中测试系统的电化学响应。电化学信号与HBV DNA的浓度在10 fM至10 nM的范围内相关，检测限（LOD）为3.74 fM。该传感器表现出优异的选择性和生物稳定性，在临床诊断中具有潜在应用价值，尤其是在资源有限的环境中。
引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝病的主要原因之一，这仍然是全球健康的一个关键问题。从急性肝炎发展到慢性肝炎，最终可能发展为肝细胞癌（HCC）[1]。鉴于HBV的广泛流行，准确和及时的检测变得日益重要。早期检测有助于及时诊断和治疗，这对于防止疾病进展和减少传播至关重要。在临床实践中，HBV感染的早期检测依赖于对特定病毒标志物的准确检测。目前，HBV检测标志物主要分为血清学标志物和分子生物学标志物[[2], [3], [4]]。其中，分子生物学标志物HBV DNA是最直接、高特异性和灵敏的HBV感染指标[5]。先前的研究表明，HBV DNA的数量与HCC或肝硬化的进展密切相关[[6], [7], [8]]。重要的是，早期HBV感染通常表现为病毒载量较低，这需要能够进行灵敏检测的诊断方法。因此，建立一种检测HBV DNA的传感方法至关重要。实时聚合酶链反应（RT-PCR）在临床实践中的HBV DNA检测中起着核心作用。然而，RT-PCR耗时且需要专业且昂贵的设备，这使得在医疗资源有限的地区难以实施[9,10]。因此，建立一种快速、灵敏且经济的HBV DNA检测策略非常重要。
电化学检测方法以其简单的设备、高分析灵敏度和用户友好的操作而著称，常用于HBV DNA分析[11,12]。例如，通过固定金纳米颗粒/还原氧化石墨烯功能化电极，并结合氧化铈/金铂纳米颗粒，构建了一种夹心型电化学HBV DNA传感器，实现了1 fmol/L至1 nmol/L的检测范围[13]。然而，大多数电化学检测方法目前需要一系列步骤将识别探针固定在电极表面，这使得过程复杂、耗时且重现性不易控制。因此，开发一种无标记的均相电化学生物传感器是改进检测方法的重要一步。我们团队之前开发了一种基于趾介导的链置换（TMSD）的均相电化学生物传感器，具有双重输出，用于检测特定DNA序列。目标DNA参与TMSD扩增，释放大量亚甲蓝到溶液中作为电化学信号。这种方法表现出可接受的准确性，并在动物物种鉴定中具有潜在应用[14]。这种生物传感器避免了探针固定和电极表面修饰。该系统可以稳定且可重复地输出电化学信号，从而提高了检测的可靠性，特别适用于HBV DNA的高灵敏度和定量检测[[15], [16], [17]]。
由于临床样本成分的复杂性，实现高选择性和高特异性检测是另一个关键挑战。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（CRISPR/Cas蛋白）被广泛用于基因编辑。CRISPR/Cas12a蛋白一旦与CRISPR RNA（crRNA）和目标双链DNA（dsDNA）结合，就可以被激活以表现出转切割活性，从而降解单链DNA（ssDNA）[[18], [19], [20]]。这种附带切割效应为核酸传感提供了一种新策略[21,22]。例如，一种利用CRISPR/Cas12a的附带切割行为的方法，可以在基于细胞的临床样本中检测人乳头瘤病毒（HPV）[23]。如何快速消除基质干扰也是一个关键问题。为了进一步减少复杂样本基质造成的干扰，经常使用基于磁珠的分离方法，因为其简单且分离效率高[24,25]。例如，使用磁珠从溶液中分离目标微RNA，并将富集的样本输送到传感器表面进行后续分析[26]。
在这项工作中，我们报告了一种能够快速且高度灵敏地定量临床样本中HBV DNA的均相电化学生物传感器。该生物传感器结合了CRISPR/Cas12a蛋白（提供高选择性和灵敏度）和磁分离技术以减少基质干扰。然后将这种生物传感器应用于血清样本分析。所提出的方法能够检测到超出HBV范围的多种疾病生物标志物。
试剂
Super Green I（20 × DMSO PCR）从北京LABLEAD Trading Co., Ltd（中国北京）获得。DNA标记物A（25-500 bp）从BBI生命科学公司（中国上海）获得。Streptavidin MagneSphere顺磁颗粒（SAMBs）从Promega Biotech Co.,Ltd（中国北京）购买。Tris-盐酸盐缓冲液（1 M，pH 7.0）从Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd（中国上海）获得。Tris-硼酸盐-EDTA（TBE）缓冲液（10 ×）从Solarbio Life获得
所提出的用于HBV DNA检测的均相电化学生物传感器原理
通过将磁珠分离与CRISPR/Cas12a系统相结合，我们开发了一种能够快速、灵敏和准确检测HBV DNA的均相电化学生物传感器。图1展示了传感机制，其中亚甲蓝（MB）作为电化学信号报告剂。单链DNA（ssDNA）在一端标记有生物素，在另一端标记有磁珠，使其可以通过强生物素-链霉亲和力与磁珠表面结合。随后，Cas12a-crRNA复合物
结论
本文报道了一种均相电化学生物传感器，该传感器结合了CRISPR/Cas12a和磁珠辅助分离技术，用于灵敏检测HBV DNA。该平台利用CRISPR/Cas12a的序列特异性识别和转切割活性，而磁分离有效地减少了基质干扰。这种设计消除了对复杂电极修饰的需求，简化了工作流程而不影响性能。该传感器表现出
CRediT作者贡献声明
杨明琦：撰写——原始草稿，研究，正式分析，数据管理。胡佳丽：软件，正式分析。张振林：数据管理。黄丽婷：撰写——审阅与编辑，验证。余雅涵：可视化，监督。邱德星：可视化，监督。祖业欣：数据管理。刘艳艳：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，资金获取。林振宇：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本项目得到了广东省基础与应用基础研究项目（2024A1515220042）、广州市科技规划项目（2024A03J0377）、国家自然科学基金（82304589）、国家自然科学基金（82404724）、广州市科技计划项目（202201020039）、珠海市科技计划项目（ZH2202200030HJL）以及广东省临床医学研究中心的支持
