耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种引起社区和医院获得性感染的病原体，是肺炎、假膜性结肠炎、败血症、心包炎和多器官功能障碍综合征等疾病的主要原因，对公共卫生和安全构成重大威胁[1,2]。近年来，抗生素的过度使用和不当使用导致许多MRSA菌株的多重耐药性（MDR）迅速增加，这是由于外排泵的过度产生。这些外排泵是跨膜通道蛋白，通过排出多种结构不同的物质来对抗抗菌剂，在MDR的发展中起着关键作用[3,4]。NorA外排泵由norA基因编码，其表达受关键转录调节因子ArlR的调控，是MRSA中的主要天然MDR外排泵。它显著降低了细菌对氟喹诺酮类、生物杀灭剂、溴化乙锭和小檗碱的敏感性[5,6]。NorA外排泵引起的MDR对MRSA的临床预防和治疗提出了重大挑战。因此，arlRmRNA是一个可靠且易于检测的生物标志物，可用于追踪药物外排的动态过程并研究药物的作用机制。
RNA检测具有挑战性，因为其在生物流体中的含量低、RNA家族内的序列相似度高、调控复杂以及不稳定性。目前主要的RNA检测方法包括Northern印迹、逆转录定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和微阵列[[7], [8], [9]]。尽管这些传统方法已被广泛采用且适用于RNA分析，但它们也有一定的局限性。Northern印迹是一种传统的基因转录水平测量技术。尽管其稳定性和可靠性较高，假阳性率较低，但该方法耗时且劳动强度大，灵敏度较低。此外，当样本中转录本含量较低时难以检测到。qRT-PCR在RNA检测方面表现出优异的灵敏度和特异性；然而，它需要昂贵的设备和专业操作人员，复杂的样本制备可能导致污染。微阵列的主要优点是可以同时检测多个目标，具有高通量。然而，由于需要昂贵的芯片制备、复杂的测试设备和大量转录本，其在临床样本RNA分析中的应用受到限制。为了克服传统方法的局限性，近年来开发了几种新的生物传感器和生物测定法，包括电化学、比色、微流控和光致发光生物测定法，以及表面等离子体共振生物传感器[[10], [11], [12], [13], [14]]。这些先进技术大大提高了灵敏度和特异性，降低了假阳性率，缩短了检测时间，并实现了即时检测（POC）。然而，它们也存在局限性，如背景信号高、电极耦合和修饰过程复杂，以及需要复杂的纳米材料修饰来提高微通道的亲水性。因此，迫切需要新的灵敏和高效的RNA检测方法。
各种DNA纳米装置，如DNA镊子、步行器和马达，为生物传感器的开发开辟了新的途径[15,16]。DNA步行器在生物分析领域表现出出色的信号放大和转导特性，因为它们具有高灵活性、效率、精确度、灵敏度和特异性。典型的DNA步行器通常由三个关键组件组成：驱动力、行走链和行走轨道[17,18]。DNA步行器的主要概念是使行走链在预定义的路径上独立且连续地移动，这种移动由链位移反应、酶促反应以及光学或化学刺激驱动[19,20]。此外，它还旨在在整个行走过程中积累和放大检测到的信号。根据移动腿的数量，DNA步行器可分为单足、双足和多足三种类型[21,22]。与前两种类型相比，多足DNA步行器具有更高的稳定性，能够移动更长的距离。此外，多足DNA步行器的移动速度明显快于单足和双足DNA步行器。因此，已经开发了许多多足DNA步行器来检测核酸、癌细胞、端粒酶活性和外泌体[[23], [24], [25], [26]]。然而，很少有研究利用基于多足DNA步行器的传感平台来检测MRSA，特别是追踪药物外排的动态过程和探索传统中药单体对外排泵的潜在抑制机制。因此，需要开发进行此类研究的方法。
酶辅助的目标回收用于信号放大已被广泛用于检测各种目标，因为它可以提高检测系统的灵敏度[27,28]。在传统方法中，目标和探针以1:1的比例混合；然而，这种方法通过酶促水解使目标能够多次参与反应，从而提高目标利用率和灵敏度。外切核酸酶III（Exo III）是一种广泛研究的外切核酸酶，无需识别特定的核酸序列即可表现出酶活性[29,30]。该酶能够催化双链DNA（dsDNA）3′端钝端或凹陷端的逐个核苷酸的逐步切割。然而，它对单链DNA（ssDNA）或超过四个碱基长度的DNA双链突出端无效。由于这些独特特性，Exo III辅助的目标回收（EATR）放大是一种高效的RNA检测方法，可以生成大量扩增的拷贝。杂交链反应（HCR）是一种信号放大策略，因其无需酶、操作条件温和、结构多样性和可控的反应动力学而受到广泛关注[31,32]。典型的HCR过程需要三个组件：两个DNA发夹和一个DNA启动子。在启动子的存在下，HP1被打开并暴露其粘性片段，与HP2的互补区域杂交。随后，HP2中新暴露的粘性片段（与启动子具有相同的序列）促进HP1的打开。两个DNA发夹之间的级联杂交反应诱导形成带有重复单元的长切口dsDNA，直到HP1或HP2的供应耗尽[33,34]。由于这些优势，HCR有潜力发展成为用于生物医学应用的强大信号放大策略。已经独立开发了许多利用EATR或HCR的生物传感器和生物测定法来检测各种分析物。然而，很少有研究同时利用EATR和HCR在一个系统中检测MRSA并监测其多重耐药性。因此，开发结合EATR和HCR的集成策略对于推进这一领域的研究至关重要。
氧化石墨烯（GO）是一种二维碳纳米材料，由于其优异的物理化学特性，在创新荧光生物分析平台的开发中引起了广泛关注[35,36]。GO的广阔表面积促进了核酸通过非共价相互作用和共价结合的结合[37]。此外，GO通常被认为能够淬灭荧光团和荧光生物分子的荧光[38]。因此，我们提出了一种创新的传感方法，该方法结合了Exo III辅助的目标回收、Nb.BbvCI驱动的DNA步行器级联放大、HCR和荧光叠加效应，在基于GO的荧光生物测定法中实现arlRmRNA的超灵敏检测。该生物测定的检测限（LOD）为87 aM，目标与非目标易于区分。此外，在实际样本中检测目标RNA时，该生物测定法表现出优异的性能，与传统方法相比没有显著差异。此外，该生物测定法不仅证明了黄芩素可以通过抑制arlR基因表达来调节外排泵活性，还阐明了外排泵与生物膜形成之间的调控相互作用。因此，这种提出的荧光生物测定法在检测MRSA中arlR基因转录方面表现出高灵敏度和选择性，具有在临床诊断、环境监测、抗菌剂筛选和药物作用机制研究中的重要应用潜力。
