《Theriogenology》：Impact of heat stress on the miRNA cargo of pre-ovulatory follicular fluid extracellular vesicles and fertility in dairy cattle
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高温热应激对奶牛繁殖力及卵泡液外泌体miRNA的影响。夏季THI指数（74）高于冬季（54），同步率（81.5% vs 100%）和受孕率（24.4% vs 39.9%）显著降低。外泌体尺寸（218 nm）和浓度（2.25e+10 particles/ml）季节间无差异，但miRNA表达谱出现显著变化，共83个差异miRNA，其中6个（如bta-miR-202、bta-miR-16a等）上调，6个（如bta-miR-1306、bta-miR-130b等）下调，这些miRNA可能通过调控卵巢功能和卵泡生理参与热应激导致的繁殖力下降。
米哈尔·安德烈·科西奥尔（Michal Andrzej Kosior）|卢卡·马西埃洛（Luca Masiello）|费德里卡·皮斯科波（Federica Piscopo）|里卡多·埃斯波西托（Riccardo Esposito）|安娜丽莎·里佐（Annalisa Rizzo）|瓦伦蒂娜·隆戈巴尔迪（Valentina Longobardi）|安娜·兰格-康西利奥（Anna Lange-Consiglio）|埃马努埃莱·卡普拉（Emanuele Capra）|芭芭拉·拉扎里（Barbara Lazzari）|保拉·加尼（Paola Gagni）|比安卡·加斯帕里尼（Bianca Gasparrini）
那不勒斯费德里科二世大学（Federico II University of Naples）兽医医学与动物生产系（Department of Veterinary Medicine and Animal Production, DMVPA），地址：Via F. Delpino 1，80137，那不勒斯，意大利
摘要
本研究旨在评估热应激对奶牛生育能力以及排卵前卵泡液中细胞外囊泡（EVs）分布和 cargo 的影响。利用农场记录的温度和湿度数据计算了夏季（S）和冬季（W）的平均温度湿度指数（THI）。通过观察夏季和冬季人工授精后的受孕率来评估牛群的生育能力。在夏季和冬季，对一组同步化的动物（每季10头）中排卵前卵泡内的 EVs 所携带的 miRNA 进行了研究。EVs 通过超速离心法分离，并通过 Nanosight、TEM 和 Western Blot 进行表征。EVs 中的 miRNA 货物通过测序获得。夏季和冬季的平均 THI 指数分别为 74 和 54。与冬季相比，夏季的同步化响应率和受孕率均下降（分别为 81.5% 和 24.4%，而冬季分别为 100% 和 39.9%）。两个季节中 EVs 的大小分布（平均大小为 218 nm）和颗粒浓度（2.25e+10 颗/毫升）相似。观察到 miRNA 货物的季节性变化，夏季有 83 个差异表达（DE）miRNA，其中最显著的包括 6 个上调的 miRNA（bta-miR-202、bta-miR-16a、bta-miR-186、bta-miR-532、bta-miR-154c 和 bta-miR-19b）和 6 个下调的 miRNA（bta-miR-1306、bta-miR-130b、bta-miR-130a、bta-miR-320a、bta-miR-1246 和 bta-miR-494）。总之，热应激显著改变了奶牛排卵前卵泡液 EVs 的 miRNA 特性。大多数差异表达的 miRNA 可能调节卵巢功能和卵泡生理，这可能解释了热应激奶牛生育能力下降的原因。
引言
由于全球气温上升和选育高产奶牛的需求，热应激（HS）已成为奶牛养殖面临的主要挑战。当动物无法散发热量时，会导致体温调节稳态失衡。热应激会显著影响奶牛的繁殖效率和生产力[1]，以及生殖性能[2][3]。此外，热应激还会抑制免疫系统[4]，从而增加乳腺炎[5]、胎膜滞留[6]和子宫炎[7]等疾病的发病率。热应激对繁殖的影响既发生在中枢层面，也发生在周围层面。受热应激影响的奶牛常常表现出下丘脑-垂体-性腺轴和周期性卵巢活动的异常[8]。据报道，热应激还会改变卵泡的优势地位，导致多卵泡周期的发生率增加[9]。在卵巢层面，热应激可通过多种机制影响激素分泌[8]和卵子质量[10]，从而降低受精卵的形成率。
热应激会通过多种方式负面地影响卵子的发育能力，即其受精和发育成胚胎的能力[11]。已知卵子的发育能力受到其生长环境的影响[12]。排卵前卵泡生长过程中的生化条件会影响高产奶牛的卵子发育能力和卵泡类固醇生成能力[13]。卵泡液（FF）是一种复杂的生物活性化合物混合物，在决定卵子质量方面起着关键作用[14][15]。然而，其成分会因环境因素而变化[16][17][18][19][20]。研究表明，热应激会影响高产奶牛卵泡中关键代谢物（如葡萄糖、胆固醇、胰岛素样生长因子 1（IGF-1）、尿素和非酯化脂肪酸（NEFAs）的浓度，这些因素与卵子发育能力相关[20]。此外，环境热应激可能在颗粒层和卵泡膜细胞的增殖和分化早期造成损伤，从而对卵泡发育和卵子质量产生长期不利影响[21]。体外实验表明，高温会直接损害颗粒层和 cumulus 细胞的功能和结构[22][23]，降低 cumulus 细胞对卵子的支持作用[23]，并改变类固醇的生成[24]。卵泡液中含有细胞外囊泡（EVs），这些由卵巢卵泡的体细胞分泌的脂质双层包裹的颗粒是类固醇生成、卵子生长和发育能力的重要调节因子，通过促进体细胞与卵子之间的通信发挥作用[25]。从卵泡液中分离出的 EVs 含有与奶牛卵巢功能和卵子发育能力相关的 miRNA[26][27]。然而，EVs 的成分会因多种因素而变化，例如奶牛的代谢状态[28]和季节性物种（如水牛）的光周期[29]，这些因素会影响卵子的发育能力。本研究的假设是热应激可能会改变卵泡液中 EVs 的 miRNA 特性，从而解释热应激奶牛卵子发育能力和生育能力下降的现象。因此，本研究旨在比较在热中性条件下或自然暴露于热应激条件下的奶牛排卵前卵泡液中 EVs 的 miRNA 货物。
实验设计
本研究评估了热应激对牛群生育能力以及排卵前卵泡液中 EVs 分布和 cargo 的影响。为此，监测了冬季（W；n = 1951）和夏季（S；n = 1089）人工授精后的受孕率来评估牛群的生育能力。
THI（平均温度湿度指数）
夏季和冬季的平均温度分别为 15.6 ± 0.3 °C 和 34.3 ± 0.5 °C。平均湿度分别为 70.0 ± 1.9% 和 44.6 ± 1.9%。平均 THI 分别为 59.0 ± 0.3 和 74.0。
牛群生育能力
热应激导致牛群生育能力下降，表现为夏季的受孕率低于冬季（分别为 24.4% 和 39.9%，P<0.01）。
对刺激方案的响应
对同步化方案的响应率分别为冬季 100%（21/21）和夏季 81.5%（22/27）。
讨论
本研究的目的是为了阐明自然暴露于热应激下的奶牛卵子发育能力下降的原因。通过深入了解相关分子机制，有望制定相应的对策。具体而言，本研究旨在探讨季节性热应激是否会影响荷斯坦奶牛排卵前卵泡液中 EVs 的 miRNA 特性。据我们所知，这是首次报道此类研究。
作者贡献声明
比安卡·加斯帕里尼（Bianca Gasparrini）：撰写、审稿与编辑、监督、概念设计。
保拉·加尼（Paola Gagni）：研究。
芭芭拉·拉扎里（Barbara Lazzari）：研究。
埃马努埃莱·卡普拉（Emanuele Capra）：撰写、审稿与编辑、验证、数据分析。
里卡多·埃斯波西托（Riccardo Esposito）：研究。
费德里卡·皮斯科波（Federica Piscopo）：研究。
卢卡·马西埃洛（Luca Masiello）：撰写、初稿撰写、数据管理。
米哈尔·安德烈·科西奥尔（Michal Andrzej Kosior）：撰写、初稿撰写、数据管理。
安娜丽莎·里佐（Annalisa Rizzo）：撰写、审稿与编辑、监督。
数据获取
数据集可向相应作者索取。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
本研究得到了 PRIN（2022 PNRR - P2022JWCYS）项目的支持，项目名称为“奶牛热应激：开发治疗策略的创新方法”（Heat stress in dairy cows: an innovative approach to develop a therapeutic strategy）；以及 CUP 项目（项目编号：E53D23020890001）的支持。
