《Theriogenology》：Novel application of a PMSG assay for measurement of circulating LH levels in horses
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Luteinizing hormone (LH)检测传统依赖放射免疫分析（RIA），存在放射性风险、操作复杂等问题。本研究验证了商用PMSG酶联免疫吸附测定（ELISA）能否替代RIA检测马匹LH，结果显示两种方法高度相关（R2=0.9361），PMSG ELISA能准确反映马匹LH周期性变化，为安全便捷的LH检测新方案提供证据。
Jaden R. Thompson | Sarah Barcalow | Ashley Stark | Kirsten E. Scoggin | Alan J. Conley | Shavahn C. Loux
肯塔基大学兽医学系，美国肯塔基州列克星敦
摘要
黄体生成素（LH）在马匹的生殖生理学中起着关键作用，但其测量传统上依赖于放射免疫测定法（RIA），这种方法存在安全性、可用性和监管方面的挑战。本研究评估了一种市售的怀孕母马血清促性腺激素（PMSG）酶联免疫吸附测定法（ELISA）作为马匹循环中LH定量替代方法的可行性。鉴于马LH与PMSG之间的肽序列100%相同，我们假设PMSG ELISA能够以高特异性和灵敏度检测LH。研究人员使用PMSG ELISA和经过验证的LH RIA分析了健康、处于发情周期中的母马的血液样本。结果显示两种检测方法之间存在强相关性（R2 = 0.9361），均能准确反映与排卵相关的LH变化模式。PMSG ELISA提供了一种实用且无放射性的LH检测方法，有助于在研究和临床应用中更广泛地使用。
引言
黄体生成素（LH）是一种由垂体前叶产生的二聚体糖蛋白激素，在马和其他哺乳动物的生殖过程中发挥着重要作用。在雌性生殖中，LH负责诱导排卵并促使颗粒细胞转化为黄体组织（即黄体）。在雄性生殖中，LH通过刺激莱迪希细胞（Leydig cells）促进雄激素的产生，这是正常精子生成所必需的。
由于放射免疫测定法（RIA）具有高灵敏度和特异性，长期以来一直用于检测循环中的LH水平[3]。因此，RIA能够检测到血清或血浆中低浓度的LH，并在确定母马排卵和季节性生殖转换相关的激素谱方面发挥了重要作用[4]。然而，RIA的使用存在显著缺点，尤其是需要使用放射性同位素，这要求严格的安全措施、专业设备以及合规性要求，这些因素可能导致成本增加并限制其普及[5]。因此，越来越多的实验室正在从RIA转向酶联免疫吸附测定法（ELISA）和化学发光测定法等替代技术。这些方法安全、易于使用且不产生放射性废物；但目前尚无专门针对马LH的市售ELISA试剂。
然而，ELISA已针对一种与马LH几乎相同的激素——怀孕母马血清促性腺激素（PMSG，也称为马绒毛膜促性腺激素eCG）进行了验证。PMSG在妊娠35至120天时由子宫内膜产生，可促进额外黄体的形成，并具有保护黄体的作用[6]。这些结构产生的孕激素能够维持妊娠，直到妊娠100至120天时胎儿-胎盘单元开始接管孕激素的生成。像PMSG这样的绒毛膜促性腺激素仅在灵长类动物和马科动物中被确认存在[7]。
作为促性腺激素家族的一员，PMSG是一种由α和β两个亚单位组成的二聚体糖蛋白激素[8]。与其他垂体前叶糖蛋白激素类似，α亚单位在不同激素间具有保守性，而β亚单位则因蛋白质而异，是决定生物活性和功能的关键因素。在人类中，β亚单位可由七个绒毛膜促性腺激素β基因（CGB）中的任何一个编码，最常见的是CGB5或CGB8[9]。相比之下，马绒毛膜β亚单位仅由一个特定的基因（NCBI基因ID：100054774）编码。该基因也是马黄体生成素（eLH）β亚单位的模板，两者之间的肽序列完全相同。两者之间的唯一区别在于糖基化模式[10,11]。尽管这两种激素具有相同的十二个O-糖基化位点，但PMSG的N-糖链分支更多、唾液酸化程度更高，O-糖基化位点的占据率也更高，其糖基化率比eLH高约10-15%。这种糖基化不仅增强了eLH的受体结合能力，还保护了PMSG免受肝脏清除机制的清除，使得PMSG的半衰期可达数天，而eLH的半衰期仅为几分钟到几小时[12, [13], [14], [15]]。
不同的糖基化模式还会影响抗体与激素的结合方式，特别是如果抗体合成使用的是蛋白质的天然形式。尽管相同的肽骨架表明共享的蛋白质表位可能被识别，但不同的糖基化模式并不能保证这一点。因此，本研究评估了这些差异是否会对ELISA的检测性能产生实质性影响。据我们所知，这是首次正式验证PMSG抗体对eLH的检测能力。
鉴于PMSG和eLH之间的肽序列完全相同，我们假设市售的马PMSG ELISA能够以高特异性和灵敏度检测eLH，从而使这两种方法可以互换使用，为LH的检测提供新的选择。
材料与方法
本研究招募了体重在400至600公斤之间、年龄在8至18岁之间的健康轻种母马，这些母马没有已知的生殖异常。母马被安置在肯塔基大学Maine Chance农场的牧场中，提供自由采食的干草和饮水，所有实验操作均符合肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的规定（批准编号：2020-3636）。
研究开始时，通过相关检测确认了5匹母马处于发情后期（diestrus）状态
结果
LH的动力学变化与先前报道的结果一致：在排卵前两天（d0）开始急剧上升，排卵时或排卵后达到峰值（图1）。然而，在周期的第5至14天，LH水平仅处于或接近基线水平，表明LH水平升高的总持续时间约为12天，但存在个体间和周期间的显著差异。
讨论
这些数据表明，这种市售的马PMSG ELISA是一种可行且可靠的替代方法，可以替代RIA用于测定eLH的水平。考虑到RIA的复杂性和风险，采用ELISA在实际应用中显著提高了检测的可行性、安全性和成本效益。在其他物种中，从RIA向ELISA平台的转变也已被成功验证。
作者贡献声明
Jaden R. Thompson：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验实施、数据分析。
Sarah Barcalow：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析。
方法学设计、实验实施、数据分析。
Kirsten E. Scoggin：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学设计、实验实施、数据分析。
Alan J. Conley：撰写、审稿与编辑、方法学验证、实验实施、数据分析。
Shavahn C. Loux：
利益声明
作者声明他们没有可能影响本文研究的任何利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢Rebecca Cotterman使用RIA方法分析马LH，以及Dr. Jan Roser提供用于RIA的LH抗血清和纯化的马LH标准品。同时，作者还要感谢Whitney Woods在样本收集和分析方面的宝贵帮助。本研究得到了林肯纪念大学/肯塔基大学夏季研究基金的资助。
