浆母细胞VH4+JH6+抗体重链使用增加：无症状多发性硬化症患者的免疫特征与疾病稳定新标志

《Genes & Immunity》：Increased VH4+JH6+ antibody heavy chain use in plasmablasts from asymptomatic multiple sclerosis patients

本研究针对如何从无临床症状的放射学孤立综合征（RIS）患者中识别出可能进展为多发性硬化症（MS）的人群这一临床难题，研究人员开展了比较RIS、临床孤立综合征（CIS）及健康对照（HC）B细胞失调特征的研究。结果发现，RIS患者浆母细胞（PB）中VH4基因家族及JH6基因使用增加，且其表达的抗体具有神经元反应性；尤其重要的是，VH4与JH6配对（VH4+JH6+）频率升高与患者未来5年病情稳定相关。该研究为在MS疾病谱系最早阶段识别疾病进展风险及稳定性提供了潜在的B细胞免疫学标志物。

　　

想象一下，在一次与头痛无关的例行脑部核磁共振（MRI）检查中，医生意外地发现了特征性的脱髓鞘病灶，但当事人却没有任何麻木、无力或视力下降等典型神经系统症状。这种情况在医学上被称为“放射学孤立综合征”（Radiologically Isolated Syndrome, RIS），它被认为是多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）可检测到的最早的临床前阶段。对于RIS患者而言，未来犹如面对一个不确定的“盲盒”：一部分人会在未来数年内出现临床症状，进展为典型的MS；而另一部分人则可能长期保持稳定，永不发病。2017年的McDonald诊断标准修订后，特别是考虑到2024年最新的诊断标准，许多RIS患者可能直接被诊断为MS，从而有资格更早地使用疾病修正治疗（DMTs）。然而，让所有RIS患者都接受DMT治疗并非最佳策略，因为近半数的患者可能永远不会出现临床症状，无端承受药物副作用和经济负担。因此，一个紧迫的临床科学问题浮出水面：能否在RIS阶段，就通过可靠的生物学标志物，精准区分出那些疾病会“前进”（Advancing）和会“静止”（Stable）的患者？

此前的研究，包括本研究团队的工作，已经发现B细胞，特别是其中一类快速分泌抗体的早期终末分化细胞——浆母细胞（Plasmablast, PB），在MS的发病机制中扮演了关键角色。例如，在出现首次临床脱髓鞘事件（临床孤立综合征，Clinically Isolated Syndrome, CIS）并最终进展为MS的患者中，其脑脊液和血液中的PB会扩增，并且这些PB倾向于使用来自可变区重链第4家族（Variable Heavy chain family 4, VH4）的抗体基因，所产生的抗体还显示出与神经元结合的特性。那么，一个自然而然的问题是：在更早的、完全没有临床症状的RIS阶段，是否已经出现了类似的B细胞异常？这些异常能否预测疾病的未来走向？

为了回答这些问题，研究人员开展了一项精心设计的对照研究。他们比较了RIS患者、CIS患者和健康对照者外周血中PB的特征，并从三个层面进行深入剖析：1) PB的频率；2) 抗体基因的使用情况（免疫遗传学）；3) 所产生抗体的反应性（自反应性）。该研究成果最终发表在《Genes & Immunity》期刊上。

研究人员开展这项研究主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用流式细胞术（Flow Cytometry）从受试者外周血单个核细胞（PBMCs）中分选和鉴定CD19+CD27++CD38+浆母细胞群体，以分析其频率。其次，对批量分选的浆母细胞进行B细胞受体（BCR）基因文库制备与高通量测序（Next Generation Sequencing），通过VDJServer、IgBLAST等生物信息学工具分析抗体可变区基因（如VH、JH家族和基因）的使用频率和配对情况。第三，通过单细胞逆转录PCR、基因合成与克隆技术，从单个浆母细胞中重组表达人源抗体（recombinant human Antibodies, rhAbs）。最后，利用蛋白质G亲和层析纯化患者血浆总IgG，并结合流式细胞术和免疫细胞化学法，系统评估了纯化IgG及重组抗体与人神经母细胞瘤细胞系SH-Sy5y的结合能力（神经元反应性）。本研究的样本队列中，RIS患者来源于ARISE临床试验的基线样本，CIS患者样本采集于其首次临床脱髓鞘事件发生时，所有受试者在采样时均未接受过疾病修正治疗。

研究结果

浆母细胞在pwRIS、pwCIS和pwMS中扩增

研究发现，无论是只有影像学异常的RIS患者，还是已有临床症状的CIS患者，其外周血中浆母细胞的频率均显著高于健康对照者，并且两者之间没有显著差异。当应用2024年修订的McDonald标准将符合条件的RIS和CIS患者统称为MS患者（pwMS）时，该组患者的PB频率也明显高于健康对照。此外，从pwMS患者血清中纯化的总IgG，与神经元结合的比例也显著高于健康对照。这表明，浆母细胞的扩增是MS相关脑炎症（无论有无临床症状）的一个共同特征。

RIS患者浆母细胞中VH4基因家族及特定VH4基因的扩增

对抗体重链可变区基因家族的深入分析显示，RIS患者浆母细胞使用VH4基因家族的比例显著高于CIS患者。其中，VH4-34、VH4-39和VH4-59这三个特定基因的使用在RIS组中尤为突出。与健康对照组相比，RIS或MS患者组的VH4总使用率并无显著差异，这提示与CIS的比较更能揭示早期无症状阶段的特异性变化。

来自pwRIS的VH4+抗体富集了对人神经元的反应性

为了探究VH4基因过度使用的功能意义，研究人员从RIS患者的浆母细胞中克隆表达了63个重组抗体（52个为VH4+，11个为VH3+作为对照）。结合实验表明，VH4+抗体与神经母细胞瘤SH-Sy5y细胞结合的比例显著高于VH3+抗体。在结合能力最强的20%的抗体中，全部使用了VH4基因。免疫细胞化学显示，这些抗体主要结合细胞内的抗原靶点。这表明，与CIS患者类似，RIS患者的VH4+浆母细胞也倾向于产生具有抗神经元自反应性的抗体。

RIS患者浆母细胞中JH6使用的扩增

抗体重链可变区由VH、D_H和J_H基因共同组成。分析发现，虽然所有组别最常使用的是J_H4基因，但RIS患者浆母细胞使用J_H6基因的比例显著高于CIS患者，导致其J_H4:J_H6比率降低。

RIS患者及病情稳定者浆母细胞中VH4与JH6配对使用的扩增

既然VH4和J_H6基因均单独呈现过度使用，研究人员进一步分析了VH4与J_H6的配对频率。结果发现，RIS患者浆母细胞中VH4+J_H6+配对的比例显著高于CIS患者。更为重要的是，当根据采样后5年内的疾病活动情况将MS患者分为“进展型”和“稳定型”时，VH4+J_H6+配对频率的升高在病情稳定的患者中更为显著。这表明，这种特定的抗体基因配对模式，可能与疾病缺乏进展（即保持稳定）的状态相关。

研究结论与讨论

本研究的发现将MS相关的B细胞免疫异常追溯到了疾病谱系中最早的可识别阶段——无症状的RIS期。研究表明，浆母细胞的扩增是RIS和CIS共有的早期免疫特征，提示B细胞活化在MS发病机制中起病甚早。

研究的核心发现之一是，RIS患者浆母细胞表现出独特的抗体基因使用偏倚，特别是VH4基因家族（尤其是VH4-34, -39, -59）和J_H6基因的过度使用，并且这些VH4+抗体富集了神经元反应性。这支持了既往观点，即MS患者体内存在针对自反应性B细胞的“外周耐受检查点”缺陷，并且这种缺陷在临床症状出现之前就已存在。这些具有自反应潜能的VH4+浆母细胞，可能是未来驱动神经炎症的预备军。

最具潜在转化价值的意义在于，研究首次发现浆母细胞中VH4+J_H6+配对频率的升高，与MS患者在采样后5年内病情保持稳定显著相关。这为预测疾病自然病程提供了一个全新的、基于抗体遗传学的潜在生物标志物。研究者推测，这或许与血脑屏障（BBB）完整性在不同疾病状态下的差异有关：病情稳定者的血脑屏障可能相对完整，使得这些VH4+J_H6+浆母细胞更多地被“滞留”在血液循环中而被检测到；而病情进展者的血脑屏障破坏更严重，使得这些细胞更易进入中枢神经系统，导致其在外周血中的比例相对降低。

当然，研究也存在局限性，例如未能明确这些抗神经元抗体的具体抗原靶点及其直接的神经病理学效应，队列中脊髓病灶比例较高，以及未能评估血脑屏障完整性的直接影响等。

综上所述，这项研究揭示了无症状RIS阶段独特的B细胞免疫谱，不仅加深了对MS最早免疫事件的理解，而且发现了VH4+J_H6+浆母细胞这一与疾病稳定相关的潜在新型标志物。未来，进一步阐明这些抗体的致病机制、评估其预测价值，并探索针对特定VH4基因谱B细胞的精准治疗策略，有望为MS的早期诊断、风险分层和个性化治疗开辟新的途径。