《Translational Oncology》：Exploring survival-associated transcriptomic subtypes in ovarian cancer using RNAseq from FFPE tissues in a clinical trial cohort
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本研究针对上皮性卵巢癌（EOC）转录组分型标准不一、预后价值不明的临床挑战，基于临床试验（ENGOT-ov24/NSGO-AVANOVA1&2）队列的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，验证了RNA测序（RNAseq）技术的可行性，并评估了现有分型算法在RNAseq数据上的适用性。研究发现，在长、短期生存者之间存在差异表达基因（DEGs），如DPEP3和SLC14A1在长期生存者中显著上调，但转录组亚型与总生存期（OS）无显著关联。该研究强调了从微阵列数据衍生的分型工具应用于RNAseq数据时的复杂性，为改进EOC的分子分型与预后工具提供了重要线索。
卵巢癌，特别是占90%以上的上皮性卵巢癌（EOC），是女性中常见的恶性肿瘤，其总体预后不佳，主要由于症状出现晚、易复发。尽管减瘤手术和铂类化疗是标准治疗，但晚期患者的5年总生存率（OS）仍不理想。近年来，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂的出现显著改变了具有BRCA1/2突变或同源重组修复缺陷（HRD阳性）患者的治疗格局，凸显了分子特征在指导治疗中的重要性。然而，在RNA层面，尽管乳腺癌等领域已有成熟的转录组分型（如PAM50分类器）用于预后和疗效预测，但在卵巢癌中，基于微阵列数据开发的多种转录组亚型分类算法尚未标准化，且其在更先进的RNA测序（RNAseq）技术，尤其是从临床常规的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中获取的数据上的适用性与预后价值，仍是一个亟待验证的挑战。
为了解决这些问题，研究人员开展了一项探索性研究。他们基于ENGOT-ov24/NSGO-AVANOVA1&2（简称AVANOVA1&2）临床试验的复发卵巢癌患者队列，利用其FFPE肿瘤样本进行RNAseq分析。这项发表在《Translational Oncology》上的研究，旨在验证从FFPE组织进行RNAseq的可行性，并评估现有转录组亚型分类器在该数据集中识别预后相关亚型的能力，同时寻找与患者长期生存相关的差异表达基因。
研究者主要采用了以下几项关键技术方法：1. 从ENGOT-ov24/NSGO-AVANOVA1&2临床试验队列的FFPE肿瘤样本中提取RNA并进行高通量测序。2. 使用R语言中的edgeR和DESeq2等生物信息学包对基因表达数据进行归一化、差异表达分析。3. 利用共识分类器R包“consensusOV”，将基于微阵列数据开发的三种卵巢癌亚型分类算法（Helland, Verhaak, Consensus）应用于原始、过滤后及模拟微阵列（“array-like”）的RNAseq数据，以评估亚型分类的一致性。4. 通过主成分分析（PCA）和层次聚类进行无监督分析，并运用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验比较不同亚型间的总生存期差异。
研究结果
Cohort（队列）
从115名符合条件的患者中收集了96份FFPE样本，其中86份含有肿瘤组织。经过RNA纯化和质量检查，最终82份样本的RNAseq数据被纳入最终分析。
Unsupervised data visualization（无监督数据可视化）
基因表达的无监督主成分分析（PCA）显示，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）共同解释了37%的变异，但样本在PC1/PC2空间中的分布与FIGO分期、组织学亚型、年龄、新辅助化疗（NACT）等临床元数据，以及与后续分配的分子亚型均无明确关联。
Unsupervised analysis of variably expressed genes（高变异基因的无监督分析）
对样本间变异最高的基因进行层次聚类分析。在由前50个高变异基因绘制的热图中，第一个聚类在视觉上较为独特，显示出免疫球蛋白家族成员和多个长链非编码RNA片段的表达上调。有趣的是，这个聚类中的样本几乎全部被分类器归类为免疫反应型（immunoreactive）。第三个聚类主要由间质型（mesenchymal）样本组成，也显示出免疫球蛋白的上调。其余两个聚类则混合了各种分配的亚型，其中第四个聚类包含最高比例的HRD阳性样本。
DEGs in long- vs. short-term survivors（长短期生存者间的差异表达基因）
短期生存者定义为自诊断起生存期≤46.5个月（约3.9年，下四分位数）的患者，长期生存者则为>79个月（约6.6年，上四分位数）。在调整诊断年龄后，共鉴定出18个在长、短期生存者间存在显著差异表达的基因。其中，15个基因显著上调，1个基因（CXCL1）显著下调。膜结合二肽酶DPEP3和尿素转运蛋白SLC14A1在长期生存者中显著上调，而趋化因子CXCL1（已知可促进卵巢癌细胞增殖）则在长期生存者中表达下调。
Classifier-subtype assignment（分类器亚型分配）
研究将共识分类器应用于原始、过滤后及模拟微阵列的三种数据集进行亚型分类。无论使用哪种数据集，当亚型定义为MES（间质型，C1）、IMR（免疫反应型，C2）、DIF（分化型，C4）和PRO（增殖型，C5）时，不同算法间的亚型分配存在显著一致性。所有三种算法在模拟微阵列数据集上的一致性最高。但算法间的一致性水平（科恩卡帕值）从0.33到0.73不等，表明一致性程度为“最低到中等”。
Overall survival between subtypes（亚型间的总生存期）
与先前研究报道不同，在本研究队列中，无论使用何种分类方法或数据集，不同转录组亚型之间的总生存期均未观察到统计学上的显著差异。即使只分析那些被所有算法一致分类的样本，也未发现生存期差异。
结论与讨论
本研究成功证明了利用临床常规FFPE组织进行RNAseq的可行性。尽管无监督分析揭示了基因表达的明显变异，但这种变异与临床元数据或现有算法分配的亚型分类并未完全对应。一个由免疫球蛋白高表达定义的独特聚类与免疫反应亚型高度相关，提示未来在免疫治疗临床试验中，基于转录组谱对免疫反应型肿瘤进行前瞻性分层，可能有助于定义对治疗更敏感的卵巢癌亚群。
在应用基于微阵列数据开发的分类器对RNAseq数据进行亚型分类时，研究发现尽管分类是可行的，且不同数据格式间的亚型分配具有统计显著性的一致，但也存在明显的不一致性。更重要的是，与预期相反，本研究并未发现不同亚型间的总生存期存在显著差异，这与近期一些研究的发现一致，提示卵巢癌的转录组分型方案及其预后价值仍需进一步精炼。
在长、短期生存者的差异表达基因分析中，鉴定出了DPEP3和SLC14A1等与较好预后相关的基因，以及CXCL1等与不良预后相关的基因。这些发现为未来抗体药物偶联物（ADC）开发和生物标志物发现提供了线索。值得注意的是，这些显著差异表达的基因均不作用于同源重组修复通路，且无监督分析也未显示出HRD状态相关的明显聚类，这提示HRD肿瘤的转录组谱本身可能具有高度异质性，或肿瘤组织的异质性可能掩盖了仅在肿瘤细胞中存在的分子信号。
总之，本研究识别了可能与预后机制和潜在药物靶点相关的显著失调基因，同时也凸显了将转录组分型应用于不同测序平台数据的复杂性及其普适性不佳的问题。尽管数据来源于严谨的临床试验队列，但样本量较小、治疗暴露异质性、以及将微阵列衍生分类器应用于RNAseq数据的技术挑战等局限性，意味着本研究结论是假设生成性的。未来需要在更大规模、更均质的前瞻性患者队列中进行验证，以完善转录组分类器，探索亚型特异性生存背后的分子机制，最终提升EOC的预后准确性并指导治疗决策。
