《Translational Oncology》：Finely-tuned regulator of DNA repair: FBXW7-185aa may modulate glioblastoma radiosensitization and the tumor immune microenvironment
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本研究聚焦于胶质母细胞瘤(GBM)对DNA损伤治疗（尤其是放疗）的内在和适应性抵抗问题。研究人员针对由环状RNA(circ-FBXW7)编码的新型蛋白FBXW7-185aa在DNA双链断裂修复（特别是非同源末端连接NHEJ通路）中的功能及其对肿瘤放射敏感性和潜在免疫微环境调节的作用展开研究。研究发现，FBXW7-185aa能够通过ATM依赖的Ser26位点磷酸化被募集至DNA损伤位点，并与XRCC4/Lig4复合物结合，通过竞争性抑制FBXW7α对XRCC4的K63连接的多聚泛素化，从而精细调控NHEJ修复过程，促进DNA损伤修复的完成。功能上，敲低FBXW7-185aa可增强GBM细胞对放疗的敏感性，并且与NEDD8激活酶抑制剂pevonedistat联用时可产生协同的放射增敏效应。该研究揭示了FBXW7-185aa作为DNA损伤修复的精细调谐因子，为理解GBM的放疗抵抗提供了新机制，并提示其可能作为连接肿瘤细胞DNA修复效率与放疗诱导的免疫调节的潜在分子节点，为开发联合治疗策略提供了新的理论依据。
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成年人中最常见、最恶性的原发性脑肿瘤，以其侵袭性强、治疗抵抗和预后极差而臭名昭著。尽管目前的“金标准”治疗包括最大范围的手术切除，辅以放疗和替莫唑胺化疗，但患者的中位生存期仍只有大约15个月，超过5年生存的患者寥寥无几。这其中，肿瘤细胞对放疗等DNA损伤性治疗产生抵抗是关键瓶颈。放疗通过诱导肿瘤细胞的DNA双链断裂（DNA Double-Strand Breaks, DSBs）来杀伤癌细胞，但GBM细胞拥有强大的DNA损伤应答（DNA Damage Response, DDR）和修复系统，特别是非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）通路，能快速修复损伤，从而“逃过一劫”，导致治疗失败。因此，深入理解并干预GBM的DNA修复机制，是提高放疗效果、改善患者预后的关键突破口。
FBXW7基因是公认的肿瘤抑制因子，其编码的FBXW7α蛋白是SCF（SKP1-CUL1-F-box）E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，能促进多种致癌蛋白（如c-Myc, Cyclin E）的降解。近年研究发现，FBXW7α还能被迅速募集到DNA损伤位点，并通过催化NHEJ核心修复蛋白XRCC4发生K63连接的多聚泛素化，从而促进DSB的高效修复。有趣的是，除了已知的三个主要剪接异构体（α, β, γ）外，科学家们还发现FBXW7基因的外显子3和4可以环化形成一种环状RNA（circular RNA, circ-FBXW7），而这个环状RNA竟然可以翻译出一个由185个氨基酸组成的小蛋白，被命名为FBXW7-185aa。这个“微型”蛋白与FBXW7α的N端167个氨基酸序列完全相同，但它缺乏FBXW7α中负责连接SCF复合物的F-box结构域以及负责底物识别的WD40重复结构域。那么，这个新发现的、看似不完整的“小兄弟”FBXW7-185aa，在DNA损伤修复这个“大舞台”上扮演着什么角色？它是否能像它的“大哥”FBXW7α一样参与调控NHEJ修复，进而影响GBM的放疗抵抗？这正是本研究试图解答的核心科学问题。
带着这些问题，来自郑州大学第五附属医院神经外科的研究团队在《Translational Oncology》期刊上发表了一项研究，系统揭示了FBXW7-185aa在GBM中作为DNA修复“精细调谐器”的新功能，并探索了其作为放疗增敏和潜在免疫调节靶点的可能性。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：激光微辐照与活细胞成像技术，用于实时观察和定量分析FBXW7-185aa及其突变体在DNA损伤位点的募集动力学；克隆形成存活实验，用于评估基因敲低或药物处理对GBM细胞放射敏感性的影响；基于报告基因的NHEJ和同源重组（HR）修复活性检测，通过pEJ5-GFP NHEJ报告系统和DR-GFP HR报告系统，在U87和T98G两种GBM细胞系中分别定量评估FBXW7-185aa对两种主要DSB修复通路的影响；免疫共沉淀和体内泛素化实验，用于探究FBXW7-185aa与XRCC4/Lig4复合物的相互作用，及其对FBXW7α介导的XRCC4多聚泛素化的调控作用；线性化质粒末端连接实验，作为另一种独立的NHEJ功能验证手段。研究使用的细胞样本为GBM细胞系（U87和T98G）。
研究结果
FBXW7-185aa在ATM磷酸化Ser26的依赖下积累于DNA损伤位点
研究人员首先探究了FBXW7-185aa是否会被募集到DNA损伤位点。通过激光微辐照诱导DNA损伤并结合活细胞成像，他们发现，虽然FBXW7-185aa和FBXW7α共享相同的N端序列（包括ATM的磷酸化位点Ser26），但FBXW7-185aa的募集速度明显慢于FBXW7α。FBXW7α在损伤后1分钟内迅速富集，而FBXW7-185aa则在约7.5-10分钟后才出现。进一步的生化实验证实，FBXW7-185aa在辐射后被ATM（而非ATR或DNA-PKcs）磷酸化，且ATM抑制剂KU55933能完全阻断其向损伤位点的募集。更重要的是，将Ser26突变为丙氨酸（S26A）后，FBXW7-185aa的磷酸化及其向损伤位点的募集均被显著抑制。这些结果表明，FBXW7-185aa以ATM依赖的方式、通过Ser26磷酸化被募集到DNA损伤位点，但其动力学与FBXW7α不同，提示其可能发挥不同的功能。
敲低FBXW7-185aa可增强GBM细胞的放射敏感性
为了解FBXW7-185aa的功能意义，研究人员在GBM细胞中敲低了FBXW7-185aa。克隆形成实验显示，敲低FBXW7-185aa能显著增强U87和T98G细胞对辐射的敏感性，其增敏效果与敲低FBXW7α相当。有趣的是，同时敲低FBXW7-185aa和FBXW7α并未产生叠加效应，暗示两者在功能上可能存在上位性关系。与放射敏感性增加相一致，敲低FBXW7-185aa导致辐射后细胞中DNA损伤标志物γH2AX的焦点持续存在，清除延迟，表明DNA修复能力受损。这些发现提示，circ-FBXW7编码的FBXW7-185aa在促进DNA修复、维持GBM细胞放疗抵抗中扮演了积极角色。
FBXW7-185aa促进NHEJ修复，但不影响HR修复
鉴于FBXW7α已知可促进NHEJ，研究人员接下来利用报告系统评估了FBXW7-185aa对两种主要DSB修复通路的影响。结果显示，在U87和T98G细胞中，敲低FBXW7-185aa能显著抑制NHEJ修复活性，其抑制程度与敲低FBXW7α相似。通过线性化质粒重新连接实验也得到了相同结论。然而，在评估同源重组修复活性的DR-GFP报告系统中，敲低FBXW7-185aa或FBXW7α均未对HR效率产生显著影响。这些数据明确表明，FBXW7-185aa特异性促进NHEJ修复通路。
FBXW7-185aa与XRCC4/Lig4复合物结合并减弱FBXW7α介导的XRCC4多聚泛素化
机制上，研究人员发现FBXW7-185aa在辐射后能与NHEJ修复的核心复合物XRCC4/Lig4发生相互作用。由于FBXW7-185aa和FBXW7α共享N端序列，它们可能竞争性结合XRCC4/Lig4。实验证实，过表达FBXW7-185aa（野生型）会显著减少FBXW7α与XRCC4的结合，而其S26A突变体则无此效应；反之，敲低FBXW7-185aa则增强了FBXW7α与XRCC4的结合。由于FBXW7-185aa缺乏E3泛素连接酶活性所需的结构域，它自身不能催化XRCC4的泛素化。然而，关键的体内泛素化实验显示，敲低FBXW7-185aa会导致FBXW7α介导的XRCC4 K63连接的多聚泛素化水平升高。这表明，FBXW7-185aa通过竞争性结合XRCC4/Lig4复合物，负向调控了FBXW7α对XRCC4的多聚泛素化。研究提出一个模型：FBXW7-185aa可能作为一种“刹车”或“调节器”，在NHEJ修复后期适时“叫停”FBXW7α对XRCC4的持续泛素化，或防止过度泛素化，从而促进DNA末端的最终连接，精细调控修复进程。
敲低FBXW7-185aa可增强pevonedistat诱导的放射增敏作用
Pevonedistat是一种NEDD8激活酶抑制剂，能抑制Cullin-RING连接酶活性，已被证实可破坏SCF-FBXW7α复合物功能，从而抑制NHEJ。研究人员假设，在pevonedistat存在下，DNA损伤位点上的FBXW7α会因无法被neddylation激活而功能丧失，此时若同时缺失能促进其“清除”或“功能转换”的FBXW7-185aa，NHEJ修复将受到更严重的损害。实验验证了这一假设：在GBM细胞中，FBXW7-185aa敲低与pevonedistat处理在抑制NHEJ活性和增强放射敏感性方面表现出协同效应。这提示，FBXW7-185aa或其上游的circ-FBXW7，可能是决定GBM细胞对pevonedistat类药物治疗敏感性的一个重要分子决定因素。
研究结论与意义
本研究首次系统揭示了由环状RNA circ-FBXW7编码的小蛋白FBXW7-185aa在胶质母细胞瘤DNA损伤修复中的新功能。研究结论可归纳为以下几点：
- 1.
功能定位：FBXW7-185aa是一种DNA损伤应答因子，它以ATM依赖的Ser26磷酸化为“门票”，被延迟募集到DNA损伤位点。
- 2.
分子机制：FBXW7-185aa通过与NHEJ核心复合物XRCC4/Lig4相互作用，并竞争性抑制其“兄弟”蛋白FBXW7α对XRCC4的K63连接的多聚泛素化，从而作为一种“精细调谐器”，促进NHEJ修复的完成。这解释了为何两者功能缺失表型相似（均损害NHEJ，增敏放疗），但作用方式不同。
- 3.
细胞表型：敲低FBXW7-185aa能损害GBM细胞的DNA修复能力，导致持续的DNA损伤和增强的放射敏感性。
- 4.
治疗启示：FBXW7-185aa的缺失能与NEDD8通路抑制剂pevonedistat协同作用，进一步削弱NHEJ并显著增敏放疗，为GBM的联合治疗策略提供了新思路。
这项研究的重要意义在于多方面：
首先，它拓展了我们对FBXW7基因功能多样性的认知。FBXW7不仅通过经典的泛素-蛋白酶体途径降解癌蛋白，其衍生的环状RNA和翻译产物还能以非经典方式直接参与DNA修复的调控，体现了基因功能的复杂性和层次性。
其次，研究为克服GBM的放疗抵抗提供了新的潜在靶点。FBXW7-185aa作为促进修复、导致抵抗的因子，其本身或其生成通路（circ-FBXW7）可能成为药物干预的靶标。与pevonedistat的协同效应更提示了联合用药的潜力。
最后，也是最具启发性的一点，研究将FBXW7-185aa的功能与肿瘤免疫微环境联系起来进行了前瞻性讨论。放疗不仅杀伤肿瘤细胞，还能通过诱导免疫原性细胞死亡、激活cGAS-STING等先天免疫感知通路来调节肿瘤免疫微环境。然而，高效的DNA修复（如FBXW7-185aa所促进的NHEJ）可能会快速清除损伤DNA，限制胞质DNA积累，从而削弱放疗的免疫刺激效应。因此，FBXW7-185aa可能构成了一个连接肿瘤细胞内在DNA修复能力与放疗介导的免疫调节的潜在分子节点。尽管其直接的免疫学效应尚待实验证实，但这一框架为未来探索“放疗-免疫”联合治疗中，如何通过调控特定DNA修复因子来增强抗肿瘤免疫应答提供了全新的理论视角。
总之，该研究发现了FBXW7-185aa在GBM中调控NHEJ修复和放疗敏感性的新机制，不仅深化了对DNA损伤修复复杂调控网络的理解，也为开发针对GBM的、基于干扰DNA修复的放射增敏和免疫联合治疗策略奠定了重要的分子基础。
