细胞系及其无血清适应衍生物在H1N1甲型流感病毒繁殖中的比较评估：架起实验室研究与工业疫苗生产应用之间的桥梁

《Vaccine》：Comparative evaluation of cell lines and their serum-free adapted derivatives for H1N1 influenza A virus propagation: bridging laboratory research and industrial vaccine production application

流感病毒疫苗生产需突破动物源性成分限制，本研究评估了HEK-293、THP-1、U937等人类细胞系在血清-free培养基中的病毒感染与生产效能，通过适应性培养和RT-qPCR、TCID50、斑点试验验证，发现所有细胞系均能有效感染并生产病毒，其中悬浮培养特性更符合工业化需求。

　　

S. Furkan Demirden | Ilgin Kimiz-Gebologlu | Suphi S. Oncel

土耳其伊兹密尔埃杰大学工程学院生物工程系

摘要

流感病毒每年都会影响许多人，对社会造成重大影响，无论是从发病率还是死亡率的角度来看。因此，疫苗作为预防流感爆发的手段越来越受到重视。然而，由于对疫苗的高需求，实现快速、高质量且经济的生产面临挑战。虽然目前使用基于鸡蛋的系统来生产流感疫苗，但需要更可控的系统来克服动物源性产品的缺点。为满足这一需求，细胞培养正成为潜在的表达平台。然而，监管机构认为在工业生产中使用动物源性成分不利于细胞培养产品的许可。因此，能够在无血清培养基中培养细胞至关重要。理想情况下，需要根据最高生产产量、生产参数的便捷性（低原材料使用量、可扩展性等）以及天然易感性来选择最合适的表达平台。在本研究中，最初将多种人源细胞系以及阳性对照和阴性对照适应于无血清培养基中生长，并进行了代谢分析以检测其变化特性。随后，使用临床分离的H1N1亚型甲型流感病毒进行了感染实验。确认所有细胞系（包括原始细胞系和适应后的细胞系）均被病毒感染后，通过RT-qPCR、TCID₅₀和斑块测定法比较了病毒生产的成功率。基于这些结果，评估了它们在流感疫苗生产中的适用性。

引言

流感（通常称为“流感”）是一种高度传染性的呼吸道疾病，可影响下呼吸道和上呼吸道[1]、[2]。这种由流感病毒引起的疾病通常表现为年度流行（季节性流感病例），但也可能引发严重的全球性大流行，例如1918-1919年的“西班牙流感”，当时约有5亿人受到影响。根据世界卫生组织（WHO）的最新数据，每年全球约有300万至500万人因流感住院，约29万至65万人死于流感[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。然而，流感病毒不仅感染人类，还会感染动物，尤其是家禽和猪，这也会导致牲畜大量死亡，而牲畜是重要的经济收入来源。在这方面，没有其他疾病像流感那样对公共卫生、经济和全球食物资源供应产生如此大的负面影响[2]、[8]、[9]、[10]、[11]。

流感病毒是快速变异的单链RNA病毒，具有病毒包膜。这些病毒被归类为正粘病毒科（Orthomyxoviridae），主要为A型，其次是B型，它们会导致人类疾病。甲型流感病毒约占全球季节性流感病例的80%-70%。虽然B型流感病毒每年都有所变化，但在季节性流感病例中更为常见，尤其是在儿童中[5]、[9]、[12]、[13]。甲型流感病毒根据其表面糖蛋白（血凝素HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原结构被分为不同的亚型。迄今为止，已鉴定出18种HA亚型和11种NA亚型。WHO将H1N1和H3N2以及B型的Victoria和Yamagata株确定为在人类中流行的流感病毒。然而，Yamagata株现在被认为已经灭绝，WHO不建议将其纳入当前的年度流感疫苗配方中[14]。因此，药物和疫苗的研发主要集中在这些3种亚型上[12]、[13]、[15]。

WHO的《2019-2030年全球流感战略》强调了季节性流感疫苗的重要性，不仅在于它们对减轻疾病负担的作用，还在于它们在加强应对大流行（如最近的COVID-19）方面的作用[16]。考虑到可及性和可负担性等多种因素，疫苗是应对流感病毒全球负担的最有效方法。目前生产的流感疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗和重组疫苗。然而，由于多年来已熟知的所有安全规定，灭活疫苗是最常用的[17]、[18]。几乎所有灭活疫苗都是使用无特定病原体（SPF）鸡蛋生产的。然而，这种生产方法存在局限性，包括过敏原风险、污染风险、病毒突变、潜在的供应链问题以及GMP法规的挑战[19]、[20]。在基于鸡蛋的流感疫苗生产中，有两个主要限制：一是需要大量SPF鸡蛋的稳定可靠供应；二是病毒在鸡蛋中持续复制可能导致突变，从而使病毒颗粒的抗原性偏离预期，从而降低疫苗的保护效果[17]、[19]。

为了满足不断增长的世界人口对疫苗的需求，并应对不断变异的流感病毒，有必要大量生产季节性和可能的大流行株疫苗[16]、[21]、[22]。为此，流感疫苗必须在高度可控和可靠的生产系统中生产。与其他病毒疫苗一样，细胞培养系统是最适合的表达平台。目前正在进行研究，以确定或开发适合工业生产的细胞系，并根据要生产的疫苗类型，在最短的时间内以最准确的抗原方式大量生产疫苗成分[23]、[24]。特别是，“物种特异性”概念——即病原病毒在宿主细胞内的复制能力——是灭活疫苗或减毒疫苗等系统的基础，这些疫苗主要侧重于病毒生产。因此，使用人类细胞生产疫苗对于保证抗原相似性、生物功能性和免疫刺激至关重要。在COVID-19大流行期间证明其生产效果后，人源细胞系（如HEK-293及其衍生物）和PER.C6已被引入工业生产[18]、[20]、[25]、[26]、[27]。此外，为了更好地遵守当前工业生产法规，建议在生产中使用无血清培养基，因为无血清培养基可以避免未知成分、潜在污染物和不良交叉反应等缺点[28]、[29]、[30]。近年来，监管机构越来越多地要求使用无血清培养基，这使得用于生产的细胞必须适应无血清培养基。此外，经常用于工业生产的细胞系还需要具备在悬浮液中生长的能力，因为悬浮培养在劳动力和成本方面比贴壁培养更具优势[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。

MDCK细胞系因其对病毒的高敏感性而被用于流感疫苗的生产。然而，这种细胞系的特性不稳定[36]，且其来源于犬类，这在复制循环中的流感病毒时可能会影响抗原准确性[37]、[38]。尽管如此，几乎所有文献研究都使用H1N1亚型“PR8”流感病毒。但这种病毒经过高度减毒处理，并已在小鼠细胞中传代并适应了细胞培养，因此在人类细胞中的复制效率可能较低。这可能会产生误导，因为最终的工业目标是使用WHO公布的候选疫苗病毒（即循环中的病毒）来生产疫苗[39]、[40]。

在本研究中，使用从流感患者临床样本中分离出的H1N1亚型流感病毒进行了生产试验。选择了多种人源细胞系（HEK-293、THP-1和U937）以及阳性对照和阴性对照细胞系（分别为MDCK和CHO-K1）。在原始细胞和根据法规模拟工业生产条件的悬浮液中进行了病毒感染性和生产实验。这些结果证明了这些细胞系具有很高的潜力，可用于未来工业生产所有基于病毒的流感疫苗。

部分摘录

细胞系

在本研究中，MDCK细胞系作为流感病毒研究的标准选择作为阳性对照[37]、[41]，而CHO-K1细胞系虽然可以被病毒感染，但不能有效产生下一代感染性病毒，因此被选为阴性对照[37]。本研究选择了HEK-293、THP-1和U937细胞进行流感病毒生产测试。THP-1和U937细胞在RPMI-1640培养基（Florabio, PROM147）中培养。

细胞系适应无血清培养基和悬浮液条件以进行病毒生产

由于时间在适应研究中至关重要，因此选择了直接适应方法。除了U937细胞外，该方法成功应用于本研究使用的所有细胞系。因此，认为U937细胞无法承受直接适应方法带来的强烈压力[31]。不过，尽管耗时较长，最终还是通过逐步适应方法使U937细胞适应了无血清培养基。

结论

本研究比较了目前工业中使用的细胞系、新引入的细胞系以及具有工业应用潜力的细胞系，特别是用于流感病毒生产的细胞系。使用人类临床样本进行这项研究与WHO关于流感季节期间从循环病毒生产疫苗的年度政策一致。由于目标是生产人类循环病毒，所有用于测试的原始细胞均选为人源细胞。

作者贡献声明

S. Furkan Demirden：撰写初稿、方法论、数据分析、概念构思。 Ilgin Kimiz-Gebologlu：撰写初稿、方法论、数据分析、数据管理、概念构思。 Suphi S. Oncel：审稿与编辑、监督、方法论、研究设计、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢埃杰大学医学院微生物学系的Candan ???EK教授及其团队捐赠了本研究中使用的临床流感病毒样本。