从罗非鱼中分离出的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的鉴定、分子分型、抗菌药敏感性及实验性致病性研究

《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Identification, Molecular typing, antimicrobial susceptibility, and experimental pathogenicity of Streptococcus agalactiae isolated from Tilapia

印度分离的副溶血链球菌（Streptococcus agalactiae）菌株经分子鉴定证实与台湾菌株亲缘关系密切，其致病性表现为LD50为1.7×10? CFU/ml，并引发宿主免疫组织炎症因子显著上调。

　　

Ritam Guha|Sudarshan Pandey|Omkar Vijay Byadgi|Shih-Chu Chen|Preetham Elumalai

印度喀拉拉邦科钦科技大学海洋科学学院海洋生物学、微生物学和生物化学系，邮编682016

摘要

由Streptococcus agalactiae引起的链球菌病在世界上广泛存在，尤其是在南亚和东南亚地区。在本研究中，从印度患病鱼类中分离出的S. agalactiae菌株通过针对GAPDH基因的PCR技术进行了分子鉴定，并通过测序进一步验证。基因分型显示不同地区的菌株之间存在显著的基因组差异；脉冲场凝胶电泳分析确定了三种脉冲型，其中印度菌株在ApaI和SmaI酶切下与两种台湾菌株紧密聚集，而ERIC-PCR分析表明印度菌株与台湾菌株的相似度超过92%。抗生素敏感性测试显示，印度菌株对四环素具有抗性，而对照菌株则没有。致病性实验测定其LD₅₀值为1.7 × 10? CFU/ml，感染鱼类表现出典型的链球菌病临床症状。感染后48小时内，头部肾脏和脾脏组织中的促炎细胞因子（IL-1β、IL-8、IFN-γ）显著升高，尽管IL-8和IL-1β在脾脏中的表达更为提前。这些结果揭示了印度S. agalactiae菌株的分子特征、毒力及免疫病理学特性，为罗非鱼养殖中的疾病监测提供了重要信息。

引言

罗非鱼（Oreochromis sp.）是一种原产于非洲和中东的淡水鱼类，属于慈鲷科（Trewavas, 1983）。20世纪下半叶，罗非鱼被引入全球多个热带、亚热带和温带地区（Bostock et al., 2010）。由于其生长迅速、适应恶劣水环境能力强、无需特殊孵化设备即可繁殖以及能食用多种食物，罗非鱼已成为水产养殖中的重要物种（Fitzsimmons, 2016）。根据联合国粮农组织（FAO）的数据（FAO Yearbook, 2017, Surachetpong et al., 2020），罗非鱼目前是水产养殖中第四大养殖鱼类。随着罗非鱼商业化对印度出口收入的显著贡献，其养殖在全国范围内变得越来越可行。越来越多的研究表明，养殖罗非鱼可能会感染多种致病微生物（Ferguson et al., 2014），尽管它们通常被认为对常见感染具有抵抗力（Evans et al., 2002）。然而，养殖强度越高，疾病爆发的风险也越大。链球菌病（由Streptococcus sp引起）的爆发给水产养殖业造成了重大经济损失。链球菌病的常见致病菌包括Streptococcus agalactiae、S. dysgalactiae、S. iniae和Lactococcus garviae（Netto et al., 2011, Li et al., 2013）。B群链球菌（GBS），即Streptococcus agalactiae的另一种名称，是一种革兰氏阳性、有荚膜的球形细菌。目前已知在水生动物中存在五种血清型：Ia、Ib、II和III（S?rensen et al., 2010, Zhang et al., 2018）。最近还发现了第九种血清型，该血清型主要积聚在脑部而非III型（Jones et al., 2003）。脉冲场凝胶电泳（PFGE）、肠杆菌重复基因间一致性（ERIC）PCR、多态性DNA随机扩增（RAPD）和多位点序列分型（MLST）常用于S. agalactiae的基因型分析（Bishi et al., 2008, Limansky et al., 1998, Rolland et al., 1999, Nguyen et al., 2002）。感染Streptococcus agalactiae的罗非鱼会出现食欲减退、单侧或双侧眼球突出、角膜混浊、皮肤或鳍基部出血、腹水以及神经症状（如旋转、环游或迷失方向）（Zamri-Saad et al., 2010）。感染后48小时内，头部肾脏和脾脏组织中的促炎细胞因子水平显著升高。使用多种抗生素可以预防链球菌感染；然而，过度使用和滥用抗生素会导致抗菌素耐药性（Deng et al., 2019, Shiomitsu et al., 1980, Suwannasang et al., 2017）。Streptococcus属细菌的耐药性通过多种分子机制产生，包括抗生素作用靶点的结构改变（如降低β-内酰胺类抗生素敏感性的青霉素结合蛋白修饰）、核糖体靶点的甲基化导致大环内酯类抗生素耐药性、以及抗菌剂的酶促失活。此外，耐药性决定因子通常通过质粒、转座子和整合接合元件等水平基因转移途径获得，从而在细菌群体内部和之间快速传播。临床和水产养殖环境中抗生素的过度使用产生的选择压力促进了耐药菌株的持续存在和传播，降低了治疗效果，并带来了严重的公共卫生和经济挑战。疫苗接种是预防该疾病的另一种方法（Suwannasang et al., Liao et al., 2020）。然而，罗非鱼的灭活全细胞疫苗未能提供足够的跨血清型和地理菌株的保护效果。由于关于印度S. agalactiae疫情的研究不足，本研究旨在探讨从养殖罗非鱼中分离出的S. agalactiae的致病性、抗菌素耐药性和遗传多样性。

本研究旨在调查从养殖尼罗罗非鱼中分离出的Streptococcus agalactiae的致病性、抗菌素耐药性和遗传多样性。同时，通过比较不同地区的菌株来了解流行病学差异及其对疾病传播的影响，并评估感染后的宿主免疫反应，以支持有效控制策略的制定，包括改进疫苗接种方法。

节选内容

从患病鱼类中分离Streptococcus agalactiae

本研究从印度喀拉拉邦埃尔纳库拉姆区的一个养殖场中采集了患病的罗非鱼样本。选择该菌株是因为它与实际发生的感染直接相关，确保用于后续分析的菌株能够准确反映该地区的致病性和流行病学特征。

患病鱼类表现出S. agalactiae感染的典型临床症状，包括嗜睡、进食减少等。

Streptococcus agalactiae

的鉴定

通过PCR技术确认了分离出的S. agalactiae菌株，在460 bp处观察到清晰的GAPDH基因条带（图1a），测序结果与S. agalactiae一致，并提交至Genbank数据库，登录号为PX132445.2。该菌株与其他S. agalactiae菌株的相似度为99%，并与先前报道的S. agalactiae菌株形成明确的进化分支。

讨论

在人类和鱼类中，GBS是一类常见的细菌，可引起兔子的败血症、牛的乳腺炎和婴儿的脑膜炎（Adikesavalu et al., 2017）。特别是在罗非鱼养殖中，Streptococcus agalactiae是导致鱼类疾病的主要链球菌种类（Ferrari et al., 2024）。在集约化养殖模式下，Streptococcus agalactiae可导致50%至70%的敏感鱼类死亡（Doran and Nizet, 2004）。这引发了严重的公共卫生问题。

结论

本研究展示了从尼罗罗非鱼中分离出的Streptococcus agalactiae的致病潜力和遗传变异，证明了其引发急性感染的能力。PFGE和ERIC-PCR分析结果之间的差异，尤其是印度和台湾菌株之间的差异，凸显了S. agalactiae的遗传多样性，表明需要结合多种分型方法来准确评估其流行病学关系。此外，研究还发现了免疫球蛋白M（IgM）水平的升高和显著的促炎细胞因子表达。

资金来源

本研究得到了印度科技部-印度国家工程院（2023/IN-TW/07）项目的支持，作者RG还获得了DST-INSPIRE奖学金（230205）的支持。

伦理批准声明

实验遵循动物实验控制和监督委员会（CPCSEA）的指南进行，申请编号：363/GO/Re/S/01/CCSEA/89。印度喀拉拉邦科钦科技大学的机构动物伦理委员会（IBSC）审查并批准了实验方案，机构生物安全委员会（IBSC）批准编号：NCAAH/CUSAT/IBSC/2024-25/09。

CRediT作者贡献声明

Ritam Guha：撰写初稿、验证、软件使用、资源获取、方法设计、数据整理。 Preetham Elumalai：撰写、审稿与编辑、监督、软件使用、资源获取、概念构思。 Omkar Vijay Byadgi：撰写、审稿与编辑、监督、软件使用、资源获取。 Shih-Chu Chen：撰写、审稿与编辑、监督、软件使用、资源获取、数据整理。 Sudarshan Pandey：数据整理。

利益冲突声明

作者声明以下财务利益或个人关系可能构成潜在的利益冲突：Preetham Elumalai表示获得了科钦科技大学的行政支持、设备、药物或试剂供应以及统计分析帮助；Preetham Elumalai与科钦科技大学存在雇佣关系。如果还有其他作者，他们声明没有已知的利益冲突。

致谢

作者衷心感谢印度科技部-印度国家工程院（2023/IN-TW/07）项目以及喀拉拉邦政府资助的喀拉拉科技大学水生疫苗开发中心的先进实验室支持，使得本研究得以顺利进行。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。