《International Journal of Nanomedicine》：Foslip-Mediated Photodynamic Treatment Reprograms Macrophages Phenotype in Tri-Culture Head and Neck Cancer Spheroids
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本研究针对头颈癌肿瘤微环境(TME)中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的促瘤M2表型导致不良预后的难题，通过构建包含FaDu癌细胞、MeWo成纤维细胞(CAFs)和U937源性巨噬细胞的三维(3D)三培养球体模型，探究了脂质体光敏剂Foslip介导的光动力疗法(PDT)对巨噬细胞的重编程作用。研究发现，Foslip-PDT在有效诱导细胞死亡的同时，能够显著上调M1表型标志物CD80并下调M2表型标志物CD206，成功将促瘤M2巨噬细胞重编程为具有抗肿瘤作用的M1表型。该研究为结合直接杀伤肿瘤与调控免疫抑制性TME的新型联合治疗策略提供了重要实验依据。
在头颈部这片复杂而精密的区域，一种名为头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的恶性肿瘤正严重威胁着人类的健康。作为全球第七大常见癌症，HNSCC因其侵袭性强、易复发转移的特点，患者五年生存率在过去数十年间始终徘徊在60%左右，难有显著突破。更为严峻的是，其发病率预计到2030年将增长30%，这使得寻找更有效的治疗策略变得尤为迫切。传统治疗手段在应对这种疾病时常常力不从心，其深层原因往往隐藏在肿瘤内部一个被称为“肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)”的复杂生态系统中。
想象一下，肿瘤并非孤军奋战的癌细胞集群，而是一座被各种“帮凶”细胞环绕和支持的“堡垒”。在头颈癌的TME中，除了癌细胞本身，还充斥着大量的非癌细胞，它们有时可占据肿瘤质量的90%之多。其中，癌症相关成纤维细胞(Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs)和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages, TAMs)是两位关键的“玩家”。CAFs如同肿瘤的建筑工人，分泌大量细胞外基质，重塑肿瘤结构，促进其生长和侵袭。而TAMs，作为肿瘤中浸润的主要先天免疫细胞，本应是身体的“卫士”，但在肿瘤的蛊惑下，它们常常“叛变”为促瘤的M2表型。这些M2型巨噬细胞不仅不攻击肿瘤，反而通过分泌免疫抑制性因子，帮助肿瘤逃避免疫系统的监视，促进血管生成和转移，与患者的不良预后密切相关。因此，如何将这群“叛变”的M2巨噬细胞“教育改造”回具有抗肿瘤功能的M1表型，成为了肿瘤免疫治疗领域一个极具吸引力且充满挑战的靶点。
在此背景下，光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)作为一种已获批用于某些癌症和癌前病变治疗的方法，展现出独特的优势。其原理是利用特定波长的光激活聚集在肿瘤部位的光敏剂(Photosensitizer, PS)，引发光化学反应产生具有细胞毒性的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，从而选择性杀伤肿瘤细胞。替莫泊芬(Temoporfin, mTHPC)是一种已被批准用于头颈癌姑息治疗的光敏剂，而其脂质体制剂Foslip?则进一步改善了药物的水溶性和肿瘤靶向性，降低了暗毒性。除了直接杀伤作用，PDT还能诱导免疫原性细胞死亡，并可能对TME中的免疫细胞产生调节作用。然而，在更接近真实肿瘤复杂结构的模型（特别是包含多种基质细胞的三维模型）中，PDT能否以及如何实现对巨噬细胞表型的重编程，此前尚不清楚。
为了回答这一科学问题，法国斯特拉斯堡大学等机构的研究人员开展了一项创新性研究，相关成果发表在《International Journal of Nanomedicine》上。他们的核心目标是：评估Foslip-PDT在一个模拟头颈癌TME的3D三培养球体模型中对巨噬细胞的光诱导“再教育”作用。这项研究旨在探索，在包含癌细胞、CAFs和巨噬细胞这三种关键成分的更真实复杂的微环境中，光动力治疗能否突破免疫抑制，将促瘤的M2巨噬细胞转变为抗肿瘤的M1“战士”。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法构建并分析了复杂的体外肿瘤模型。首先，他们利用液体覆盖技术，成功构建了由人咽鳞癌细胞系(FaDu)、人黑色素瘤源性成纤维细胞系(MeWo，作为CAFs模型)和经PMA(Phorbol Myristate Acetate)诱导分化的U937单核细胞源性巨噬细胞(M0)组成的3D多细胞肿瘤球体。他们建立了包括单纯癌细胞球体、癌细胞与CAFs共培养球体、以及在此基础上再浸润巨噬细胞的三培养球体在内的多种模型体系。其次，综合运用了免疫组织化学/免疫荧光染色、流式细胞术和定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription PCR, qRT-PCR)等多种技术，对球体模型的细胞组成、空间分布、上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)特征以及巨噬细胞的表型（M1/M2相关基因和表面标志物）进行了全面的表征，验证了模型模拟体内TME关键特征的能力。再者，通过流式细胞术和荧光显微镜成像，精确评估了脂质体光敏剂Foslip在不同类型球体模型及各细胞组分中的积累和分布情况。最后，在应用Foslip并进行不同光剂量(10, 20, 40 J/cm2)的激光照射后，利用流式细胞术同步检测了PDT诱导的细胞死亡（碘化丙啶染色）以及巨噬细胞表型的变化（通过检测M1标志物CD80和M2标志物CD206的表面表达），从而在同一个实验体系中关联了治疗的直接杀伤效应与免疫调节效应。
研究结果
1. 成功构建并表征了模拟HNSCC TME的3D三培养球体模型
研究人员成功构建了FaDu癌细胞与MeWo成纤维细胞(CAFs)共培养，并浸润M0巨噬细胞的三维球体模型。流式细胞术和图像分析显示，巨噬细胞在球体中实现了约30-40%的浸润，且分布均匀。模型呈现出典型的肿瘤-基质相互作用特征：CAFs在球体周边成簇分布；免疫组化显示E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调，而N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和纤连蛋白(Fibronectin)表达上调，这些证据共同表明模型发生了上皮-间质转化(EMT)，这是肿瘤侵袭转移的关键步骤。更重要的是，qRT-PCR分析揭示，浸润在球体中的巨噬细胞主要表现为促瘤的M2表型，其标志物CD163、程序性死亡配体-1(PDL-1)、白细胞介素-10(IL-10)和趋化因子CCL2的表达显著上调，而抗肿瘤M1表型的标志物如CD80、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等表达较低或持平，这高度模拟了临床HNSCC中M2-TAMs占主导的免疫抑制状态。
2. Foslip在巨噬细胞富集的球体中积累更显著
通过流式细胞术检测平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity, MFI)发现，Foslip在单纯癌细胞球体(F5)和癌细胞/CAFs共培养球体(F5Mw5)中的积累水平相似。然而，一旦球体中浸润了巨噬细胞，无论是与癌细胞共培养(F5+M10)还是三培养(F5Mw5+M10)，Foslip的整体积累量均显著增加，达到无巨噬细胞球体的2-3倍。进一步细胞分型显示，这种积累量的增加主要归因于巨噬细胞对Foslip的高摄取，而癌细胞和CAFs的摄取水平并未因巨噬细胞的加入而发生显著变化。荧光显微镜观察也证实Foslip在球体中积累，且荧光信号多集中在球体外围。
3. Foslip-PDT在不同模型中诱导了相似水平的细胞死亡
尽管Foslip在巨噬细胞富集的球体中积累更多，但光动力治疗诱导的细胞死亡效果在不同模型间却无显著差异。在10至40 J/cm2的光剂量范围内，单纯癌细胞球体、癌细胞/CAFs共培养球体以及三培养球体均表现出剂量依赖性的细胞死亡，且各模型在相同光剂量下的死亡率相近。这表明，虽然巨噬细胞更多地摄取了光敏剂，但这并未转化为对整体球体更强的直接杀伤力，可能由于光穿透深度、氧含量分布或细胞间保护效应等因素的制约。
4. Foslip-PDT在三培养模型中成功诱导巨噬细胞向M1表型重编程
这是本研究最关键的发现。PDT处理后24小时，通过流式细胞术分析巨噬细胞表面标志物发现，在癌细胞/巨噬细胞共培养球体(F5+M10)中，较高光剂量(20和40 J/cm2)可导致M1标志物CD80表达增加，并伴随M2标志物CD206表达的下降。而在三培养球体(F5Mw5+M10)中，这种重编程效应更为显著和广泛：在10 J/cm2的光剂量下即可观察到CD80表达的显著上调，在20和40 J/cm2下，CD80表达持续升高，同时CD206表达显著降低。这一结果明确表明，Foslip-PDT能够改变肿瘤微环境中巨噬细胞的表型，使其从促瘤的M2状态向抗肿瘤的M1状态转变。值得注意的是，这种重编程效应在包含CAFs的三培养模型中尤为明显，提示CAFs的存在可能通过释放某些炎症信号因子，增强了PDT后的免疫调节效果。
研究结论与意义
本研究通过构建一个高度模拟人头颈鳞状细胞癌肿瘤微环境的3D三培养球体模型，首次在如此复杂的体外体系中证实，基于脂质体光敏剂Foslip的光动力疗法不仅能够有效杀伤肿瘤细胞，更具有重新编程肿瘤相关巨噬细胞表型的免疫调节功能。研究得出结论：Foslip-PDT能够将促肿瘤的M2型巨噬细胞重编程为具有肿瘤杀伤能力的M1型巨噬细胞，这种效应在包含癌症相关成纤维细胞的三培养模型中更为显著。
该研究的核心意义在于为头颈癌治疗提供了新的思路和实验依据。它超越了对PDT直接杀伤作用的传统关注，将视野扩展至其对肿瘤免疫微环境的深刻调控。将M2巨噬细胞“改造”为M1巨噬细胞，有望逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，激活抗肿瘤免疫反应，从而可能抑制肿瘤生长、延缓转移，并与PDT的直接细胞毒性产生协同增效作用。这为开发“直接肿瘤杀伤”与“肿瘤微环境调控”相结合的新型联合治疗策略奠定了坚实的理论基础。尽管本研究使用的U937细胞模型有一定局限性，且未来需要更多标记物和功能实验来验证重编程巨噬细胞的具体抗肿瘤活性，但这项研究无疑开辟了一条利用纳米光动力技术靶向调控肿瘤免疫微环境、特别是重编程巨噬细胞的新途径，为改善头颈癌等实体瘤的治疗预后带来了充满希望的前景。
