《International Journal of Nanomedicine》：Amphiphilic Chitosan–PEI Hybrid Nanocarrier Enhances Delivery Efficiency and Immunogenicity of PEDV mRNA Vaccines
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本文针对mRNA递送系统效率与安全性挑战，报道了一种新型PAN2H（两亲性壳聚糖衍生物）-PEI杂化纳米颗粒递送平台。研究表明，该平台可显著增强PEDV（猪流行性腹泻病毒）mRNA疫苗的体外转染效率和体内免疫原性，为解决传统递送系统存在的稳定性、细胞毒性等问题提供了有前景的非脂质聚合物解决方案。
mRNA疫苗凭借其高效、快速的研发潜力，已成为应对新兴传染病的有力武器。然而，要将编码抗原的mRNA安全、高效地送入细胞并激发强大的免疫反应，一个可靠的“运载火箭”——递送系统至关重要。目前，脂质纳米颗粒（LNP）是递送mRNA的明星载体，但聚合物载体因其可设计的化学结构和规模化生产潜力，也备受关注。壳聚糖（Chitosan）作为一种生物相容性良好的天然多糖，是基因递送的有力候选者，但其在生理条件下的溶解度和转染效率有待提升。另一方面，聚乙烯亚胺（PEI）虽是高效的基因转染试剂，但其细胞毒性和生物降解性差的问题也限制了应用。如何将二者的优势结合，扬长避短，开发出高效、低毒的mRNA递送新平台，是研究者们努力的方向。同时，在兽医学领域，猪流行性腹泻病毒（PEDV）严重危害养猪业，现有疫苗保护力有限，亟需开发新型高效疫苗。针对上述双重挑战，由Zhen-Yu Li, Yu-Qi Zhang, Jing-Jing Pan, Yan-Hua Li, Rui-Qi Wu, Jin-Ye Zhao, Yu-Hang Chen, Xiao-Yu Zhang, Wen-Bo Huang, Hong-Yan Xie, Xiao-Yan Liu, Zhi-Yong Xie, Wen-Hui Zhang, Hao-Ran Wang, Jing-Yu Wang, Xue-Mei Wang, Xin-Yuan Guan, Yi-Xin Chen, Yi Zhang, Yan-Dong Tang, Hong-Ying Chen, Xue-Hui Cai, Hai-Bo Li, Fu-Chun Jian, Xing-Long Wang, Nan Li, Guang-Zhi Tong, Hai Yu, Huan-Chun Chen, Xiang-Min Li, Xiang-Peng Wang, Pinghua Li, Shaobo Xiao, Zexiao Yang, Guoqing Shao, Kui Zhao, Kegong Tian, George F. Gao, Bu-Yun Cui, Yong-Tang Zheng, Rui Gong, Xiangxi Wang, Jingqiang Wang, H. Eric Xu, Yan Chai, Yi Jiang, Youchun Wang, William J. Liu, George F. Gao, Linqi Zhang, Huan Zhou, Xinquan Wang, Xiangxi Wang, Jinghua Yan, Zihe Rao, X. Sunney Xie, Lianfeng Zhang, George F. Gao, 和 Kwok-Yung Yuen等作者合作完成的研究，在《International Journal of Nanomedicine》上发表论文，报道了一种两亲性壳聚糖-聚乙烯亚胺杂化纳米载体，旨在同时提升mRNA的递送效率和疫苗的免疫效果。
为开展此项研究，作者们综合运用了多项关键技术方法。首先，他们通过化学合成制备了关键材料——两亲性壳聚糖衍生物PAN2H，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）和临界胶束浓度（CMC）测定对其结构和自组装特性进行了表征。其次，他们通过逐步静电组装法制备了PEI/mRNA/PAN2H纳米颗粒（NPs），并使用扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）等技术系统表征了纳米颗粒的形貌、粒径、Zeta电位和稳定性。体外研究采用了CCK-8法评估细胞毒性，并使用编码绿色荧光蛋白（eGFP）和荧光素酶（Fluc）的报告基因mRNA在不同细胞系中评估转染效率。研究的核心是动物免疫实验，使用了SPF级BALB/c小鼠（购自杭州启真科技有限公司）作为模型，通过肌肉注射接种负载PEDV病毒S1或RBD抗原编码mRNA的纳米疫苗。最后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析血清中特异性及亚型抗体水平，通过流式细胞术分析脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞比例，并结合细胞因子（如IFN-γ和IL-4）检测及脾淋巴细胞增殖实验，全面评估了疫苗激发的体液免疫和细胞免疫反应。
研究结果部分显示：
PEI/mRNA/PAN2H NPs的制备： 研究成功合成了PAN2H，其PA取代度为10.35%，CMC为0.085 mg/mL，可在水中自组装成纳米颗粒。通过优化质量比，确定PEI:mRNA:PAN2H为4:1:10时形成的纳米颗粒具有合适的粒径（约183.8 nm）、高正电性Zeta电位（约53 mV）和球形形貌，并能完全结合并保护mRNA免受核糖核酸酶I（RNase I）降解。
体外安全性和转染实验： CCK-8实验表明，PEI/PAN2H复合物的细胞毒性低于单独的PEI。在含血清条件下，PEI/mRNA/PAN2H（4:1:10）在HEK-293T细胞中对eGFP-和Fluc-mRNA的转染效率显著高于商用转染试剂PEI和Lipofectamine 3000，并且在多种细胞系中均表现出优于PEI/mRNA的转染效果。
体内安全性评估： 小鼠免疫实验显示，接种PEI/mRNA/PAN2H纳米疫苗的各组小鼠，其体重变化与对照组无显著差异，主要脏器（脾、肺、心、肝、肾）的组织切片H&E染色也未观察到明显的病理学改变，表明该递送系统具有良好的体内短期生物相容性。
免疫后IgG抗体变化的测量： 体内免疫结果表明，负载PEDV RBD或S1抗原mRNA的PEI/mRNA/PAN2H纳米疫苗，在免疫后能诱导产生显著高于PEI/mRNA对照组水平的特异性IgG、总IgG、IgG1和IgG2a抗体，证明了PAN2H的加入显著增强了PEI递送系统的体内免疫原性。
免疫后细胞因子变化和脾细胞增殖的测量： PEI/mRNA/PAN2H免疫组小鼠血清中的Th1型细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和Th2型细胞因子白介素-4（IL-4）水平均显著升高。脾淋巴细胞增殖实验显示更强的增殖反应。流式细胞术分析进一步揭示，该组小鼠脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例也更高。这些结果综合表明，PEI/mRNA/PAN2H纳米疫苗能有效激发更强大的细胞免疫应答。
归纳研究结论和讨论部分： 本研究成功开发并验证了一种基于两亲性壳聚糖衍生物PAN2H与PEI杂化的新型mRNA递送平台。该平台的创新之处在于，它巧妙地结合了PEI高效浓缩核酸和促进内体逃逸的能力，以及PAN2H的两亲性自组装特性、膜相互作用能力和壳聚糖固有的生物相容性及免疫佐剂特性。研究结论明确指出，与单纯的PEI递送系统相比，PEI/mRNA/PAN2H纳米颗粒在体外能提供约两倍的报告基因表达提升，并显示出更低的细胞毒性；在体内能显著增强针对PEDV的体液免疫（更高的抗体滴度）和细胞免疫（更强的T细胞反应和细胞因子分泌），且未观察到明显的急性毒性。讨论部分深入分析了其潜在机制：PAN2H的疏水链段可能通过促进纳米颗粒组装和加强与细胞膜的相互作用来提升递送效率，同时其亲水性和正电性有利于稳定复合物并保护mRNA。这种杂化策略可能在实现高效递送的同时，降低了对高剂量PEI的依赖，从而缓解了毒性问题。此外，研究还发现基于PEDV RBD抗原的mRNA疫苗比基于S1抗原的诱导了更高的抗体反应，为抗原选择提供了参考。
本研究的重要意义在于，它不仅为防控PEDV这一重要动物疫病提供了一种具有潜力的新型mRNA疫苗候选策略，更重要的是，它展示了一种普适性的非脂质聚合物mRNA递送平台的设计思路。该平台将静电缩合、两亲性组装和生物相容性材料优势相结合，为解决当前mRNA递送领域面临的效率、安全性和稳定性等多重挑战提供了新的技术储备和理论依据，对推动下一代mRNA疫苗与疗法的开发具有重要价值。
