《Cells》：A Neutrophil-like Cell Model as Substitute for Human Neutrophils in NETs and Thrombosis Research
Yu Shi,
Helen R. McPherson,
Timea Feller,
Simon D. A. Connell,
Helen Philippou,
Robert A. S. Ari?ns and
Julia S. Gauer
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本研究针对在血栓形成与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）研究中，原代人中性粒细胞存在体外寿命有限、供体间差异及伦理限制等问题，提出并验证了可诱导分化的髓系细胞PLB-985作为其理想替代模型的可能性。通过扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）等结构生物学技术，研究发现分化后的PLB-985细胞及其NETs在形态、结构和促凝功能（如增厚纤维蛋白纤维）方面与人中性粒细胞高度相似，证实了该模型在体外研究中的有效性、可重复性与伦理优势，为相关基础与转化研究提供了实用的细胞工具。
在我们身体的免疫防御前线，中性粒细胞扮演着至关重要的角色。当遇到细菌等病原体时，它们不仅会通过吞噬等方式直接攻击，还会上演一场壮烈的“自爆”——释放出由DNA、组蛋白和颗粒蛋白构成的网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）。NETs能像蜘蛛网一样捕获并杀死病原体，是先天免疫的重要武器。然而，越来越多的研究发现，这把“双刃剑”在凝血和血栓形成中也扮演了关键角色。NETs能促进血小板聚集、纤维蛋白形成和血栓稳定，与多种心血管疾病（如中风、静脉血栓栓塞）的病理过程密切相关。
然而，要深入研究NETs在血栓形成中的具体机制，科学家们面临着一个现实困境：作为研究材料的原代人中性粒细胞，其体外存活时间极短，且存在供体间的个体差异，同时大量获取也涉及伦理问题。这些限制严重阻碍了相关研究的可重复性和规模化开展。那么，能否找到一个可靠、易得且伦理可接受的替代品呢？
近期发表于《Cells》期刊的一项研究，为这个难题提供了一个颇具前景的解决方案。该研究聚焦于一种名为PLB-985的细胞系，这是一种人类早幼粒白血病细胞，可以在二甲基亚砜（DMSO）的诱导下分化为具有中性粒细胞样特性的细胞。研究旨在系统评估分化后的PLB-985细胞及其产生的NETs，在结构和功能上能否有效模拟原代人中性粒细胞，从而验证其作为替代模型用于NETs与血栓形成研究的可行性。
为了回答这个问题，研究人员开展了一系列精细的实验。他们首先从健康志愿者体内分离出原代人中性粒细胞作为“金标准”，同时培养并诱导分化PLB-985细胞。随后，他们使用佛波酯（PMA）分别刺激这两种细胞，诱导其形成NETs。研究的核心在于运用高分辨率的成像技术，直观地比较两者及其NETs的细微差别。扫描电子显微镜（SEM）被用来观察细胞和NETs的整体形貌、表面结构以及它们如何影响凝血后形成的纤维蛋白网络。而原子力显微镜（AFM）则能提供更精细的三维表面形貌和纳米级别的结构测量，比如单个NET纤维的直径和高度。
主要技术方法
本研究主要采用了以下关键技术：1) 从健康志愿者（经伦理委员会批准）采集血液，通过密度梯度离心法分离原代人中性粒细胞；2) 对PLB-985细胞系进行培养，并使用含有DMSO的培养基诱导其分化为中性粒细胞样细胞；3) 使用PMA刺激分化后的PLB-985细胞和原代人中性粒细胞，诱导NETs形成；4) 利用扫描电子显微镜（SEM）对细胞、NETs以及它们在血浆中形成的凝块进行超微结构成像和定量分析（如细胞直径、纤维直径）；5) 利用原子力显微镜（AFM）在空气模式下对分化后的PLB-985细胞及其NETs进行表面形貌扫描和纳米级尺寸测量。
3.1. SEM确认PLB-985细胞具有中性粒细胞样形态和丝状特征
通过SEM观察，研究人员发现，分化后的PLB-985细胞在形态上与人中性粒细胞高度相似，都表现出细胞膜表面起皱和瓣状结构。细胞直径测量显示，分化后的PLB-985细胞（平均6.94 μm）与人中性粒细胞（平均7.31 μm）大小相当，但显著小于未分化的PLB-985细胞。此外，在两种细胞表面都观察到了丝状结构，但分化后的PLB-985细胞表面的这些丝状物平均直径（129.8 nm）显著大于人中性粒细胞（96.3 nm）和未分化细胞，提示分化过程伴随明显的表面结构重塑。
3.2. AFM显示分化后PLB-985细胞和NETs的表面形态与力学特性
AFM成像进一步揭示了分化后PLB-985细胞粗糙的表面形貌及其NETs的精细结构。NETs呈现出中心隆起、外围延伸出纤维网络的典型结构。对单个NET纤维的高分辨率测量显示，其宽度约为0.12-0.20 μm，高度在16.3至59.4 nm之间，远大于单个DNA双螺旋的厚度，这与NETs由解聚的染色质和蛋白质复合物组成的理论相符。
3.3. SEM揭示人和PLB-985 NETs诱导产生可比的凝块网络
SEM图像显示，无论是PLB-985细胞还是人中性粒细胞产生的NETs，都能形成精细的、DNA样的纤维网络。定量分析表明，PLB-985 NETs的纤维平均直径（35.2 nm）显著大于人源NETs（23.0 nm）。一个关键发现是，仅在PLB-985来源的NETs中观察到了直径为84.0至1126.7 nm的球形颗粒，其形态类似于微囊泡，这可能暗示了一种额外的、NETs介导之外的促凝血机制。
3.4. NET诱导凝块中的纤维蛋白纤维直径具有可比性
在探究NETs如何影响血栓结构时，研究人员分析了由NETs参与形成的血浆凝块。SEM显示，PLB-985 NETs和人源NETs诱导产生的纤维蛋白网络整体形态相似，两者常交织在一起形成复合网状结构。更重要的是，对纤维蛋白纤维直径的量化结果显示，两者均能显著增加纤维蛋白纤维的厚度（分别比单纯凝血酶对照组增厚1.52倍和1.58倍），且两者之间无显著差异。这表明，在改变凝块超微结构这一关键功能上，PLB-985来源的NETs与人源NETs效果相当。
研究结论与重要意义
综合以上结果，本研究得出明确结论：经过诱导分化的PLB-985细胞系，能够有效地模拟原代人中性粒细胞的关键结构和功能特性，特别是在形成NETs以及通过NETs影响纤维蛋白结构、促进血栓形成方面。该细胞模型产生的NETs虽然在纤维直径上略有差异，并含有独特的囊泡样颗粒，但在核心的促凝功能——增厚纤维蛋白纤维、改变凝块结构上，与人源NETs表现一致。
这项研究的意义重大。首先，它系统地从形态学和功能学层面验证了PLB-985细胞作为人中性粒细胞替代模型的可靠性，为解决原代细胞来源受限、伦理顾虑和实验可重复性差等问题提供了一个“伦理上负责任、实用且可重复”的体外研究工具。这对于推动NETs在血栓形成、炎症（“血栓-炎症”）、感染及相关疾病领域的基础与应用研究至关重要。其次，研究不仅证实了NETs促凝的共性，还发现了PLB-985模型特有的囊泡样结构，这为探索NETs之外（如微囊泡相关组织因子）的促凝机制提供了新的线索。最后，研究者也坦诚指出了当前技术的局限（如SEM下难以区分NET纤维与纤维蛋白纤维），并前瞻性地提出了结合AFM-荧光成像等新技术来深化研究的未来方向。总之，这项工作为学界提供了一个强大的细胞模型，将有助于更深入、更便捷地解密中性粒细胞及其释放的“天罗地网”在健康与疾病中的复杂角色。
