《International Journal of Molecular Sciences》：Comparative Study of Redox Status of MDCK Cells in Chicken Embryo Extract Versus Fetal Bovine Serum
Jun-Hyun Kim,
Jin-Mi Park,
Mi-Kyung Nam,
Seung-Min Hong,
Eun-Ju Kim,
Sun-Young Hwang,
Kyoung-Ok No,
Mee-Hyun Lee,
Kang-Seuk Choi and
Hyuk-Joon Kwon
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为解决传统胎牛血清（FBS）在细胞培养中可能导致细胞表型漂移、丧失上皮细胞特性等问题，本研究探讨了鸡胚提取物（CEE）作为FBS的替代补充物。研究人员通过比较MDCK细胞在CEE和FBS中的氧化还原状态和代谢组学，发现CEE能通过激活NOX-NRF2抗氧化轴，维持氧化稳态，避免FBS诱导的代谢负担和线粒体应激，为维持体外细胞模型的生理准确性提供了新见解。
在生命科学研究和生物技术产业中，细胞培养是获取细胞、观察生命过程和筛选药物的基石。其中，营养丰富、成分复杂的胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）是培养基中最常见的补充剂，长期以来被视为细胞生长的“黄金标准”。然而，FBS的使用也带来一系列困扰研究人员的“麻烦”：价格高昂、批次间差异大、存在潜在的伦理争议。更重要的是，此前的研究已观察到，某些细胞在FBS中长期“生活”后，可能会“迷失”自我，发生表型漂移——即细胞过度增殖，失去原有的形态和功能特性。以犬肾上皮细胞（Madin-Darby Canine Kidney, MDCK）为例，FBS就曾被发现会驱动其过度增殖，损害其上皮细胞身份和纤毛发生。这就像是为细胞提供了一个不自然、过于“肥甘厚味”的生长环境，虽然长得快，但却“长歪了”。
为了寻找更理想的替代品，研究人员将目光投向了鸡胚提取物（Chicken Embryo Extract, CEE）。他们之前的研究已显示，改良的CEE在维持细胞生长、活力和内在特性方面表现出色。为了深入探究CEE与FBS如何从底层代谢机制上引导细胞走向不同的命运，来自Jun-Hyun Kim、Jin-Mi Park等作者的研究团队，在《International Journal of Molecular Sciences》上发表了一项研究，系统比较了在CEE和FBS中培养的MDCK细胞的氧化还原状态和代谢组学特征。这项研究旨在解答：CEE是否通过创造一个更优越的代谢微环境，来避免氧化应激诱导的表型漂移，从而成为一个更稳定、更可靠的FBS替代方案？
研究人员主要应用了多项关键技术来回答上述问题。细胞模型采用MDCK细胞，分为CEE补充组和FBS补充组。关键实验技术包括：1）多种荧光探针（如H2DCFDA、DHR123等）结合荧光分光光度法和流式细胞术，检测细胞内和线粒体活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）及钙离子水平；2）通过酶联免疫吸附测定、荧光染色等方法评估氧化应激对脂质、蛋白质和DNA的损伤；3）通过定量实时聚合酶链反应和蛋白质印迹法分析NADPH氧化酶、抗氧化酶等关键分子的表达；4）染色质免疫沉淀技术分析关键转录因子与DNA的结合；5）基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱的代谢组学分析，全面解析细胞代谢谱的差异。统计学分析则使用了单因素方差分析等。
1. ROS和Ca2+水平在MDCK-CEE和MDCK-FBS细胞中的差异
研究发现，两种细胞表现出截然不同的ROS生成模式。与MDCK-FBS细胞相比，MDCK-CEE细胞的总细胞内ROS（由H2DCFDA检测）、超氧阴离子（Dihydroethidium检测）和过氧化氢（Amplex Red检测）水平更高。然而，关键的差异在于线粒体ROS（DHR123检测）和线粒体钙离子水平，这两者在MDCK-FBS细胞中显著更高。这表明，CEE可能通过其他膜氧化酶诱导“有益”的信号ROS，而FBS则迫使细胞转向依赖氧化磷酸化的代谢状态，导致了线粒体应激。
2. 氧化应激对MDCK-CEE和MDCK-FBS细胞造成的损伤
尽管MDCK-CEE细胞的细胞内ROS水平更高，但通过检测8-异前列烷（脂质过氧化标记物）、蛋白质羰基化产物和8-氧代鸟嘌呤（DNA氧化损伤标记物）等，研究人员发现，在两种细胞之间，脂质、蛋白质或DNA的氧化损伤标志物均无显著差异。这表明，CEE诱导的ROS并未造成明显的氧化损伤，这符合“氧化应激”的概念，即生理水平的ROS是必要的信号分子。
3. MDCK-CEE和MDCK-FBS细胞中的NADPH氧化酶（NOX）表达
为解释ROS来源的差异，研究人员检测了产生活性氧的酶的表达。他们发现，在MDCK-CEE细胞中，产生超氧阴离子的酶NOX1和NOX2的mRNA和蛋白表达均上调。而产过氧化氢的酶（如NOX4、DUOX2）则表现不一。这直接证实了CEE诱导的ROS升高主要源于质膜上的NOX1/2系统，与线粒体无关。
4. 抗氧化酶在MDCK-CEE和MDCK-FBS细胞中的表达
在抗氧化防御系统方面，两组细胞采取了不同的策略。MDCK-CEE细胞主要上调了位于线粒体的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的表达。而MDCK-FBS细胞则倾向于上调胞浆中的CuZnSOD和谷胱甘肽过氧化物酶。在谷胱甘肽合成通路的组件上，两组间无差异。
5. MDCK-CEE和MDCK-FBS细胞中的 核因子E2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2, NRF2）表达与活性
NRF2是调节抗氧化基因表达的关键转录因子。研究发现，在MDCK-CEE细胞中，NRF2的核转位更为频繁。染色质免疫沉淀实验进一步揭示，MDCK-FBS细胞中的NRF2更多结合在CuZnSOD基因的启动子区，而MDCK-CEE细胞中的NRF2则优先结合在MnSOD基因的启动子区。这解释了为何两组细胞会激活不同的抗氧化酶“套餐”，从而形成针对其各自氧化应激来源的特异性防御。
6. MDCK-CEE和MDCK-FBS细胞的代谢组学分析
代谢组学结果清晰地揭示了两组细胞代谢景观的根本差异。在MDCK-FBS细胞中，尿毒症毒素（如马尿酸、苯乙酰甘氨酸）的积累显著更高，这些毒素已知可诱导线粒体功能障碍。同时，尿苷水平也更高，这可能促进细胞增殖。相反，MDCK-CEE细胞富含多种抗氧化剂和谷胱甘肽前体，包括抗坏血酸、脯氨酸和N-乙酰-DL-谷氨酸。此外，一种信号分子5-羟基吲哚-3-乙酸（5-HIAA）仅在CEE细胞中被检测到。这些代谢物的差异表明，CEE提供了一个富含抗氧化剂、支持内源性防御的代谢微环境。
在讨论和结论部分，作者们将上述发现整合为一个清晰的模型，深刻阐释了CEE优于FBS的底层机制。研究揭示了两种血清补充剂驱动的两条截然不同的细胞命运路径。FBS迫使MDCK细胞（一种本源性依赖糖酵解的细胞）的代谢向氧化磷酸化转变，造成了“代谢失配”。这导致线粒体ROS和钙超载的累积，再加上尿毒症毒素的聚集，共同构成了慢性代谢负担，迫使细胞进入高代谢状态以维持生存，从而驱动过度增殖和上皮-间质转化的激活，最终损害上皮细胞的稳定性。相比之下，CEE则支持了一条更接近细胞本性的路径。CEE诱导的ROS主要来源于细胞膜上的NOX1/2，这些ROS作为一种上游信号，增强了NRF2的核转位及其对MnSOD启动子的结合，从而特异性上调了线粒体和胞内的关键抗氧化防御。同时，CEE提供的抗坏血酸、脯氨酸、5-HIAA等代谢物，直接构成了一个保护性的代谢微环境，支持细胞的“氧化应激”状态，即生理性的氧化还原信号。这最终帮助细胞维持了内在的糖酵解代谢模式，避免了线粒体应激，从而稳定了上皮细胞的身份、生理性增殖速率和形态完整性。
因此，本研究不仅证实了CEE作为FBS替代品的潜力，更重要的是，它从氧化还原和代谢层面揭示了CEE维持细胞生理稳态的新机制。其核心在于，CEE通过NOX-NRF2轴的协调激活，利用生理水平的ROS信号来强化内源性抗氧化防御，而FBS则诱导了有害的氧化应激。这一发现强调了培养基补充剂对细胞命运的决定性影响，为优化体外细胞模型、提高实验结果的可重复性和生理相关性提供了关键的代谢与氧化还原视角。
