《Pharmaceuticals》：Myricetin Inhibits Osteosarcoma Cell Viability and Modulates EMT-Related Genes Associated with the SNAI1/MMP-9 Axis
Isabela Santos,
Hélio M. T. Albuquerque,
Marta Teixeira Pinto,
Nuno Mendes,
José Miguel P. Ferreira de Oliveira and
Eduarda Fernandes
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本期《Pharmaceuticals》推荐一篇聚焦骨肉瘤治疗新策略的研究。为克服传统化疗毒性大和肿瘤易转移的难题，研究人员探究了黄酮类化合物杨梅素(myricetin)的抗骨肉瘤潜力。研究发现，杨梅素可选择性抑制骨肉瘤细胞活力，与阿霉素(doxorubicin)协同增效，并通过下调EMT（上皮-间质转化）相关基因SNAI1和MMP-9抑制肿瘤迁移，在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型中证实其体内抑瘤活性。该研究为开发骨肉瘤的辅助治疗新药提供了有前景的候选分子。
骨骼，作为人体的支架，本应是坚固可靠的堡垒。然而，一种名为骨肉瘤的恶性肿瘤，却常常侵袭青少年和儿童，成为最常见的原发性骨癌。尽管数十年来，以甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂组成的MAP方案是标准疗法，但患者的生存率已进入平台期，难以进一步提升。这背后是两大“顽敌”：一是高剂量的化疗药物带来了心脏毒性、肾脏损伤等严重的副作用，让治疗本身成为一把双刃剑；二是骨肉瘤细胞极易发生早期肺转移，一旦扩散，患者的生存希望便急剧下降。因此，寻找能够增强现有化疗疗效、同时抑制肿瘤转移且毒性更低的新型辅助疗法，成为临床亟待攻克的难关。
在此背景下，一类广泛存在于水果、蔬菜中的天然化合物——黄酮类物质，因其显著的抗氧化和抗癌潜能进入了科学家的视野。它们能否成为对抗骨肉瘤的新武器？由Isabela Santos, Hélio M. T. Albuquerque, Marta Teixeira Pinto, Nuno Mendes, José Miguel P. Ferreira de Oliveira 和 Eduarda Fernandes组成的研究团队在《Pharmaceuticals》上发表的研究，对这一问题进行了深入探索。他们从一系列黄酮类化合物中，筛选出了杨梅素(myricetin)这颗“明星分子”，并系统揭示了其通过调控SNAI1/MMP-9信号轴，选择性杀伤骨肉瘤细胞、协同增强阿霉素疗效、并抑制肿瘤生长的多重作用机制。
为开展这项研究，作者运用了几个关键的技术方法：首先，通过WST-8和SRB细胞活性/生长检测，在四种骨肉瘤细胞系(MG-63, Saos-2, HOS, 143B)和正常肺成纤维细胞(MRC-5)中筛选和评估化合物毒性及选择性。其次，使用CompuSyn软件分析，采用固定比例组合法评估杨梅素与阿霉素的相互作用。接着，利用细胞划痕/伤口愈合实验和二维共培养体系评估细胞迁移和侵袭能力。然后，通过RT-qPCR(实时定量聚合酶链式反应)技术检测上皮-间质转化(EMT)相关基因的表达。最后，在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)异种移植模型中验证杨梅素的体内抗肿瘤活性。研究所用的骨肉瘤细胞系和MRC-5细胞均购自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。
研究结果
2.1. 在骨肉瘤细胞中进行细胞毒性筛选
研究人员首先测试了五种黄酮类化合物对四种骨肉瘤细胞系的细胞活力和细胞生长的抑制作用。结果显示，杨梅素(化合物A1)对所有测试的骨肉瘤细胞系都表现出最强的细胞毒性效果，尤其对侵袭性最强的143B细胞最为敏感，其半抑制浓度(IC50)最低。重要的是，杨梅素对正常的MRC-5肺成纤维细胞毒性很低，其IC50值约为对143B细胞的5倍，显示出良好的选择性。细胞周期分析表明，杨梅素处理并未引起细胞周期阻滞，但引发了细胞膜起泡、胞质减少等现象，提示其作用机制更偏向细胞毒性而非细胞静止。
2.2. 杨梅素与阿霉素协同降低骨肉瘤细胞活力
为了评估杨梅素作为辅助疗法的潜力，研究检测了其与临床常用化疗药阿霉素的相互作用。使用固定比例(69:1, 杨梅素:阿霉素)组合处理143B细胞24小时后，CompuSyn软件分析显示，联合用药的组合指数(CI)小于1，表明两者具有协同作用，且这种协同效应在较高效应水平(如抑制90%细胞活力)时更为明显。这意味着联合使用可以减少阿霉素的有效剂量，从而可能降低其带来的毒副作用。
2.3. 杨梅素和阿霉素的协同作用抑制143B细胞迁移
肿瘤细胞的迁移和侵袭是转移的关键步骤。通过细胞划痕实验发现，单用杨梅素或单用阿霉素在测试浓度下对143B细胞的迁移抑制效果不显著。然而，两者联合(20 μmol/L 杨梅素 + 0.36 μmol/L 阿霉素)却能显著抑制细胞的迁移能力。在二维共培养侵袭模型中，无论是单药还是联合用药，均未对143B细胞的侵袭表现出显著抑制作用，这可能与实验体系缺乏致密的细胞外基质屏障有关。
2.4. 杨梅素下调骨肉瘤细胞中EMT相关转录因子
上皮-间质转化(EMT)是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。通过RT-qPCR检测发现，杨梅素处理能显著下调143B细胞中EMT关键转录因子SNAI1(在15 μmol/L时)和基质金属蛋白酶MMP-9(在30 μmol/L时)的基因表达，而对ZEB1和MMP-2的表达影响不一致或没有显著影响。这表明杨梅素可能通过特异性抑制SNAI1/MMP-9轴来干扰EMT进程，从而发挥抗转移潜力。
2.5. 杨梅素通过减少CAM异种移植物中的肿瘤生长而表现出抗肿瘤活性
为了在体内验证杨梅素的疗效，研究采用了鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)异种移植模型。将143B细胞与杨梅素或阿霉素混合后接种到鸡胚CAM上，培养7天后观察肿瘤生长。结果显示，与溶剂对照组相比，杨梅素处理能显著减小移植瘤的面积，其效果虽不及阳性对照阿霉素，但明确证实了杨梅素在体内具有抑制骨肉瘤生长的能力。组织切片也显示，杨梅素处理组的肿瘤细胞区域减少，基质区域相对增加。
研究结论与意义
本项研究系统阐明了天然黄酮类化合物杨梅素在对抗骨肉瘤中的多重作用。其核心结论在于：杨梅素能够选择性抑制骨肉瘤细胞（尤其是高转移性的143B细胞）的活力，同时对正常细胞的毒性较低，具有良好的治疗窗口。更为重要的是，杨梅素与一线化疗药物阿霉素表现出显著的协同效应，这种联合策略不仅增强了抗肿瘤活性，特别是抑制了细胞迁移，还可能为临床降低阿霉素的使用剂量、从而减轻其心脏毒性等副作用提供新思路。在机制层面，研究首次在骨肉瘤模型中揭示，杨梅素的抗转移潜力与其下调EMT通路中的关键因子SNAI1和效应蛋白MMP-9有关，即通过抑制SNAI1/MMP-9信号轴来发挥作用。最后，利用CAM体内模型，研究直观地证实了杨梅素能够有效抑制肿瘤生长，为其抗癌活性提供了直接的体内证据。
这项研究的深刻意义在于，它从一个天然产物出发，为解决骨肉瘤临床治疗中的核心困境——化疗毒性和肿瘤转移——提供了一个充满希望的综合性策略。杨梅素不仅自身具有抗肿瘤选择性，还能作为“化疗增敏剂”和“转移抑制剂”，与现有疗法形成互补。尽管该研究也存在一些局限，如主要集中使用143B细胞系、缺乏蛋白水平验证以及体内模型的复杂性不足等，但其发现无疑为将杨梅素开发成为骨肉瘤的辅助治疗药物奠定了坚实的临床前基础，指明了未来深入探索其分子靶点、优化给药策略以及进行更复杂模型验证的方向。
