《OncoImmunology》：Immunogenicity of neoantigens from hepatocellular carcinoma patients treated with a combined radioimmunotherapy
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本研究聚焦肝细胞癌(HCC)患者对免疫检查点抑制剂(ICI)响应率低的难题，探讨了在接受选择性内放射治疗(SIRT)联合抗PD-1抗体Nivolumab治疗的NASIR-HCC试验队列中，新抗原(neoAg)特异性免疫反应的存在与特征。研究人员通过体外免疫反应检测和HLA转基因小鼠体内免疫实验，证实无论患者是否获得临床获益，其肿瘤新抗原均具较强免疫原性，且多表位肽疫苗可诱导更广泛T细胞应答，为针对无临床获益HCC患者的个性化新抗原疫苗开发提供了关键实验依据。
肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，尽管免疫检查点抑制剂(ICI)已成为晚期患者的一线治疗选择，但其客观缓解率仍徘徊在20%–36%之间，完全缓解率更是低至3–5%。这背后的一大症结在于肝细胞癌通常具有中等的肿瘤突变负荷(TMB)，导致其可能产生的新抗原(neoAg)数量有限，从而削弱了肿瘤的免疫原性。那么，那些对现有联合疗法（如放疗联合抗PD-1治疗）无临床获益的患者，其肿瘤是否真的缺乏有效的免疫靶点？他们体内是否存在足够多具有免疫原性的新抗原，可以作为个性化疫苗的“弹药库”，重新点燃抗肿瘤免疫反应？这项发表在《OncoImmunology》上的研究，正是为了揭开这个谜题。
为了回答上述问题，研究团队深入分析了NASIR-HCC临床试验（CA209-992）的队列。该试验中，肝细胞癌患者接受了选择性内放射治疗(SIRT)联合抗PD-1抗体Nivolumab的治疗。研究人员从该队列中筛选了11名患者（6名有临床获益[B]，5名无临床获益[NB]）的样本进行研究。他们首先利用患者肿瘤和血液样本进行全外显子组测序(WES)和RNA测序(RNAseq)，通过生物信息学管道预测出由突变衍生的新抗原。随后，他们合成了对应的肽段，在体外用患者的外周血单个核细胞(PBMC)进行刺激实验，并通过γ-干扰素(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISPOT)检测来评估T细胞反应。更进一步，为了不受肿瘤微环境免疫抑制的影响、全面评估新抗原的免疫原性潜能，研究选取了4名无临床获益且携带特定HLA等位基因（HLA-A02:01或HLA-DRB1 * 01）的患者，将其预测的新抗原在表达相应人类HLA分子（HLA-A02.01和HLA-DRB1 * 01）的转基因HHD-DR1小鼠体内进行免疫接种实验。最后，他们还在该小鼠模型中比较了两种疫苗平台（多表位长肽疫苗与基于Semliki森林病毒(SFV)的DNA疫苗）激发新抗原特异性免疫反应的效果。
研究所用的主要关键技术方法包括：
- 1.
患者队列与样本分析：基于NASIR-HCC临床试验队列，收集患者基线及治疗后的肿瘤组织和外周血样本。
- 2.
基因组学与生物信息学：对肿瘤和正常组织进行全外显子组测序(WES)和RNA测序(RNAseq)，通过生物信息学流程（涉及多种突变识别工具和NetMHCpan等算法）预测和筛选肿瘤特异性新抗原。
- 3.
体外免疫反应评估：分离患者外周血单个核细胞(PBMC)，在体外用新抗原肽段池刺激扩增后，使用IFN-γ ELISPOT法检测抗原特异性T细胞反应。
- 4.
体内免疫原性验证：利用HLA-A*02.01/HLA-DRB1 * 01双转基因的HHD-DR1小鼠模型，通过皮下接种新抗原肽段（辅以佐剂）或DNA疫苗的方式进行免疫，随后取脾脏淋巴细胞，同样采用IFN-γ ELISPOT法评估疫苗诱导的T细胞反应强度和特异性。
研究结果
1. 新抗原特异性反应存在于肝细胞癌患者中
通过体外刺激和ELISPOT检测，研究发现80%的患者（包括75%的B患者和83%的NB患者）能检测到新抗原特异性T细胞反应，分别识别了37%和63%的测试新抗原。这表明无论临床获益与否，肝细胞癌患者体内普遍存在针对肿瘤新抗原的自发免疫反应。
2. 来自无临床获益患者的预测新抗原能有效结合HLA分子并在HHD-DR1小鼠中具有免疫原性
研究选取了4名NB患者的新抗原进行深入验证。体外结合实验显示，大部分预测的HLA-A02.01限制性新抗原肽（87.5%-94%）能有效结合HLA分子。在HHD-DR1小鼠体内免疫实验中，这些新抗原显示出很高的免疫原性：83%的HLA-A02.01限制性新抗原和66%的HLA-DRB1 * 01限制性新抗原能诱导免疫反应，且其中绝大多数反应（如82%的HLA-A*02.01新抗原）特异性针对突变肽而非野生型(WT)肽。肽段浓度滴定实验进一步证实了这种特异性。
3. 包含I类限制性新抗原的多表位疫苗的构建
为了评估疫苗潜力，研究尝试了两种多表位疫苗策略。一种是使用包含天然侧翼序列的15聚体长肽疫苗，另一种是基于SFV的DNA疫苗，其编码串联的相同新抗原序列。在HHD-DR1小鼠中，肽疫苗（联合poly(I:C)和抗CD40佐剂）诱导了更广泛和更强的T细胞反应（对患者17和30的新抗原识别率分别为75%和66%），而DNA疫苗仅能有效诱导针对一个表位的反应。
研究结论与意义
本研究系统证实，在接受SIRT联合抗PD-1治疗的肝细胞癌患者中，无论其是否从该联合治疗中获得临床获益，其肿瘤均能产生并被免疫系统识别具有免疫原性的新抗原。这打破了“无临床获益等于缺乏免疫靶点”的简单假设。
更为关键的是，通过利用HLA转基因小鼠这一“洁净”的体内模型，研究揭示了一个重要事实：从无临床获益患者肿瘤中预测出的大部分新抗原（HLA I类83%，II类66%）实际上具有强大的免疫原性，能够有效诱导特异性T细胞反应。这表明，这些患者体内并不缺乏可用于疫苗开发的“弹药”，而是其自身的免疫系统在肿瘤微环境抑制等因素影响下，未能有效启动或维持足够强的攻击。
在疫苗平台的选择上，研究指出，基于多表位长肽并辅以合适佐剂（如poly(I:C)）的疫苗策略，在诱导广泛且强效的新抗原特异性T细胞反应方面，优于所测试的基于SFV的DNA疫苗平台。这为后续个性化新抗原疫苗的临床转化提供了重要的技术路径参考。
综上所述，这项研究为肝细胞癌，特别是对那些现有免疫联合疗法无效的患者，开展个性化新抗原治疗性疫苗提供了坚实的理论依据和实验支持。它表明，通过疫苗接种主动扩大和增强患者体内本已存在但可能受抑制的新抗原特异性T细胞反应，是一条值得深入探索的、有望改善肝细胞癌免疫治疗疗效的新策略。
