综述：催化活性在VRK3中的出现：对一个前伪激酶调控网络的磷酸化蛋白质组学见解

《Proteomes》：Emergence of Catalytic Activity in VRK3: Phosphoproteomic Insights into the Regulatory Network of a Former Pseudokinase Ayadathil Sujina, Amal Fahma, Suhail Subair, Rajesh Raju and Poornima Ramesh

这篇综述通过整合大规模磷酸化蛋白质组学数据，系统解析了长期以来被视为无催化活性的假激酶VRK3的磷酸化调控网络。研究发现VRK3存在32个高置信度磷酸化位点，其功能通过上游激酶和相互作用蛋白构成的复杂网络，调控ERK、Hippo和GPCR等关键信号通路，并与胶质瘤、肝癌等疾病密切相关，为靶向VRK3相关网络治疗提供了新见解。

　　

综述：催化活性在VRK3中的出现：对一个前伪激酶调控网络的磷酸化蛋白质组学见解

1. 引言

疫苗相关激酶3 (VRK3) 是VRK丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，长期以来因其激酶结构域中存在关键的氨基酸替换、缺乏ATP结合位点以及活性位点构象的显著改变而被归类为真正的伪激酶。然而，最新研究表明，其N端催化外结构域（第1-147位氨基酸）能够介导屏障自整合因子 (BAF) 的磷酸化。除了这一新发现的催化活性，VRK3还在细胞周期调控、染色质重塑以及作为支架蛋白调节细胞外信号调节激酶 (ERK) 信号通路中发挥重要作用，并与神经发育障碍和癌症（如肝癌）的发生发展相关。尽管如此，从磷酸化蛋白质组学视角对VRK3的调控网络，包括其上游激酶、互作蛋白和共调控伙伴的认识仍存在巨大空白。

2. VRK家族

VRK家族包括VRK1、VRK2和VRK3三个成员，尽管结构相似，但功能各异。VRK1是活跃的核激酶，磷酸化包括BAF在内的染色质相关底物，调控核膜动态、染色质结构和DNA损伤反应，与癌症治疗耐药性及神经系统疾病相关。VRK2也是活性激酶，作为支架蛋白调节MAPK信号通路，并与精神疾病和癌症相关。与此相对，VRK3长期以来被视为伪激酶，主要通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥调节功能，例如通过激活双特异性磷酸酶VHR/DUSP3来促进ERK去磷酸化，从而抑制ERK通路活性。这展示了该激酶家族的功能多样性。

3. VRK3的磷酸化图谱

通过对2010年至2025年间发表的3825篇基于质谱的磷酸化蛋白质组学研究进行系统检索和筛选，本研究整合了115项明确鉴定出VRK3磷酸化事件的研究，并进一步归类为635个人类细胞磷酸化蛋白质组学分析数据集。从中，共鉴定出VRK3上的32个高置信度磷酸化位点。其中，S59、S82和S83是磷酸化蛋白质组学数据中最常被检测到的位点，在不同生物条件和实验环境中表现出一致的差异磷酸化。值得注意的是，这些优势位点均位于其激酶结构域之外。

4. 与特定VRK3磷酸化位点共差异丰度蛋白质的功能关联

VRK3在S59、S82和S83的磷酸化将其与参与多种基本生物过程的广泛蛋白质网络联系起来。研究列出了与VRK3磷酸化表现出保守共磷酸化模式的蛋白质。主要的共丰度蛋白包括PTPN2、CDC20、SRRM2、SRSF2、RIOK1、FOXK2等。这些蛋白质功能多样，涉及炎症信号调节、有丝分裂进程调控、核糖体生物合成、mRNA剪接、转录调控、细胞骨架重塑和细胞周期控制等。这强调了VRK3优势磷酸化位点在信号转导、转录控制、剪接、细胞骨架动力学和细胞周期调控等过程中的广泛调节功能。

5. 可能调控VRK3磷酸化的上游激酶

迄今为止，实验上仅知细胞周期蛋白依赖性激酶5 (CDK5) 可介导VRK3的磷酸化，二者协同调控谷氨酸诱导的氧化应激中的神经保护机制。通过结合NetworKIN、AKID、iKiP-DB等工具预测以及Johnson等人的合成肽库筛选 (PSAP分析) 数据，研究构建了VRK3的潜在上游激酶网络。在VRK3的所有磷酸化位点中，共有33个激酶被确定为其潜在上游调控因子。这些激酶主要属于酪氨酸激酶 (TK)、酪氨酸激酶样 (TKL)、STE20样激酶 (STE)、CMGC激酶（包括CDK、MAPK、GSK、CLK家族）、钙/钙调蛋白依赖性激酶 (CAMK)、AGC激酶家族、酪蛋白激酶1和非典型激酶等家族。

这些上游激酶的特定磷酸化位点也与VRK3的优势位点显示共差异丰度。例如，TGFBR2 (S548) 和EEF2K (S445) 与VRK3 (S59) 共丰度；LATS1 (S464, S613) 与VRK3 (S82) 共丰度；TTBK2 (S786) 和GRK2 (S685) 与VRK3 (S83) 共丰度。这些关联将VRK3的磷酸化与生长因子通路 (TGFBR2)、翻译与代谢控制 (EEF2K)、肿瘤抑制与器官大小调控 (Hippo通路中的LATS1)、细胞骨架调控 (TTBK2) 以及GPCR介导的信号传导 (GRK2) 联系起来，表明VRK3可能作为一个多通路整合器，协调细胞对内外部刺激的反应。

6. 可能调节VRK3功能的蛋白质互作因子

作为细胞中的信号支架，VRK3的大部分功能通过蛋白质-蛋白质相互作用进行调节。从多个蛋白质互作数据库中提取VRK3的实验已知互作因子后发现，其中多个磷酸化蛋白与VRK3磷酸化存在共差异丰度。例如，PCYT1A、EMD、HSPA4、H1-4、RPLP2、VIM、NCL、FOXP1和ATXN2与所有三个VRK3优势位点均显示共差异丰度。这些一致的磷酸化趋势提示了一种协调的调控机制，强调了VRK3在调节特定信号事件中的核心作用。

通过STRING分析 (互作置信度阈值：0.9) 发现VRK3与双特异性磷酸酶DUSP3 (VHR) 存在直接相互作用。尽管在本研究的数据集中未直接检测到VRK3与DUSP3的互作，但多个DUSP3的互作蛋白被发现与VRK3相关蛋白存在共差异丰度并相互连接，形成了一个连接VRK3和DUSP3的扩展网络，提示了间接的调控关系。这些发现共同将VRK3定位为一个磷酸化依赖的信号枢纽，可能通过中间蛋白影响DUSP3介导的信号传导，并协调多种细胞和应激反应通路。

7. VRK3相关疾病的功能启示与新兴方向

VRK3在发育阶段高丰度表达，并通过磷酸化核膜相关蛋白BAF参与细胞周期进程调控。它还通过直接与核内丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶VHR/DUSP3相互作用来抑制ERK活性，从而成为ERK信号通路的关键调节因子。在神经系统背景下，VRK3被认为是神经元功能所必需的。研究表明，在氧化应激条件下，VRK3的S108位点可被CDK5磷酸化，这种修饰限制了持续的ERK激活并防止细胞死亡，突出了其在细胞保护和应激调节中的作用。本研究的磷酸化蛋白质组学数据整合显示，与优势磷酸化位点相比，S108在不同实验条件下的磷酸化并不频繁，提示CDK5介导的VRK3磷酸化可能参与应激调节通路。

通过全激酶组RNA干扰筛选，VRK3被确定为携带H3K27M突变的胶质瘤细胞存活所必需。其表达沉默会导致G1期细胞周期阻滞并干扰染色质凝聚。在成人胶质瘤中，VRK3的高丰度与不良预后临床相关，其对H3K27M突变细胞的选择致死性表明存在肿瘤特异性的治疗窗口。VRK3还通过控制细胞周期阶段参与肝癌的病理生理过程。肝细胞癌组织和细胞系中VRK3水平升高，其敲低会导致细胞周期阻滞在S和G2/M期，这些效应似乎通过与中心粒蛋白 (CNTRN) 和SPIN1等重要调控蛋白的相互作用介导。这些研究表明VRK3可能是肝癌的致癌驱动因子，但现有研究尚未探讨不同的VRK3磷酸化状态是否贡献于其肿瘤特异性功能，这是磷酸化蛋白质组学分析可以解决的关键空白。

8. 解读VRK3信号架构：通路汇聚与调控功能

通过肽库筛选方法，LATS1被鉴定为可磷酸化VRK3 (S82) 的上游激酶。LATS1是调控器官大小、细胞凋亡和增殖的Hippo信号通路的核心组件，这一发现提示VRK3的功能可能受到Hippo通路动态的调控，暗示了Hippo信号与VRK3介导的调控之间存在潜在的交互对话。作为ERK信号的关键调节因子，VRK3通过直接与磷酸酶VHR/DUSP3相互作用来减弱ERK活性。VRK3与ERK活性之间的平衡对于维持受控的细胞生长和分化至关重要。此外，新证据表明VRK3通过与组蛋白和表观遗传因子（如JARID2）相互作用，参与染色质组织和转录调控。在胶质瘤中，抑制VRK3会导致G1期细胞周期阻滞和代谢改变，而在头颈部鳞状细胞癌中，较高的VRK3水平与患者较好的生存率相关。这些发现共同确立了VRK3在癌症生物学和治疗靶向方面的潜在意义。本研究鉴定的共差异磷酸化调控网络为理解VRK3调控如何整合到不同通路和生物过程中提供了一个框架。

9. 结论

本研究通过对大规模质谱数据集的综合分析，揭示了VRK3（人源VRK3经典亚型）上存在32个磷酸化位点，其中S59、S82和S83是优势位点。对激酶-底物数据的整合分析发现了一组33个共同的上游激酶，提示存在一个保守的调控轴来控制VRK3相关的磷酸化事件。更重要的是，对共差异磷酸化的VRK3互作因子的鉴定，突显了其在协调Hippo、ERK和GPCR介导的网络等多种信号通路中更广泛的参与。这些发现将VRK3定位为一个积极的参与者而非被动的支架，在癌症生物学、神经退行性疾病和细胞周期调控中具有重要启示。未来研究应聚焦于通过突变分析和生化实验验证预测的上游激酶并确定VRK3磷酸化位点的功能意义，在疾病模型（特别是胶质瘤和肝细胞癌）中探索VRK3的情境依赖性功能，可能揭示其作为诊断标志物或治疗靶点的用途。