《Analytica Chimica Acta》：Development of a Dual-Nanobody Sandwich Immunochromatographic Strip Based on a Site-Directed Conjugation Strategy for Ultrasensitive Detection of Staphylococcal Enterotoxin B (SEB)
编辑推荐：
高效SEB检测新方法：基于纳米抗体对的化学发光免疫分析及荧光层析试纸开发，解决蛋白A干扰问题，检测限达0.034 ng/mL，15分钟快速出结果。
郝正|龚婷婷|陈开元|牛文佳|毛玉琳|侯健|卢志龙|罗晨|孙铁强|沈志强
上海海洋大学食品科学与技术学院，中国上海201306
摘要
背景
葡萄球菌肠毒素B（SEB）是一种高效且稳定的生物毒素，是食物中毒的主要原因，对食品安全和公共卫生构成重大威胁。尽管侧向流动免疫测定（LFIA）因其低成本和快速现场检测能力而受到重视，但由于葡萄球菌蛋白A与常规抗体的Fc区域的非特异性结合，其在检测SEB方面存在挑战。为克服这一限制，从免疫噬菌体展示纳米体库中成功筛选出一系列针对SEB的纳米体对。
结果
筛选采用了一种高效的一步法夹心化学发光免疫测定技术，该技术策略性地使用了带有Avi标签和碱性磷酸酶融合的纳米体（Nb-Avi和ALP-Nb）。基于最优纳米体对（Nb9A和Nb9C），开发出了一种灵敏的时间分辨荧光侧向流动免疫测定方法，用于快速检测SEB。这包括选择与硝酸纤维素膜兼容的纳米体融合蛋白，并建立了一种先进的定向策略来标记纳米粒子。所得试纸条可在15分钟内完成检测，检测限低至0.034 ng/mL，线性范围为0.10–6.3 ng/mL，显著优于大多数现有方法。由于纳米体完全不含Fc片段，因此在免疫层析系统中具有很强的抗蛋白A干扰能力。在实际样品分析中，该方法表现出84.40%–114.21%的一致回收率，以及出色的特异性和稳定性。
意义
本研究提出了一种创新的侧向流动免疫测定方法，通过使用纳米体对克服了实现高灵敏度和快速检测SEB的关键挑战。该方法能够快速、超灵敏且特异性地检测SEB，在复杂样品中表现出高可靠性，并为现场食品安全监测和公共卫生保护提供了一种可靠的解决方案，同时也为检测其他蛋白质毒素提供了新的战略框架。
引言
SEB是金黄色葡萄球菌产生的肠毒素中最强的毒素，是导致葡萄球菌食物中毒并发症的主要因素[1]。它是一种超级抗原，无需经过抗原呈递细胞的处理，可直接与MHC II类分子结合，触发大量的T细胞激活和强烈的免疫反应，包括细胞因子风暴。由于其高稳定性、易于传播和高度毒性，SEB被列入《联合国生物武器公约》的禁用生物毒素名单[2]、[3]。因此，开发高灵敏度和快速检测SEB的方法对于确保食品安全和公共卫生安全至关重要。
免疫测定方法因操作简便、高灵敏度和高通量能力而在食品和环境监测中得到广泛应用[4]、[5]。在这些方法中，LFIA在葡萄球菌食物中毒的及时决策中发挥着重要作用，因为它简单、检测快速、成本效益高且对非专家用户友好[6]、[7]。传统的AuNPs-LFIA已在食品安全检测中得到广泛应用，但其较低的灵敏度限制了微量生物毒素的检测[8]、[9]。为了克服这一缺点，制备了许多新型纳米颗粒以开发多功能和灵敏的LFIA，如Fe3O4@Au/PDA[10]、金@铱纳米花[11]、AIEgens[12]、磁性量子点[13]。在各种纳米材料中，封装有时间分辨荧光铕(III)复合物（FMs）的聚苯乙烯微球表现出独特的发光特性，包括强烈的荧光、狭窄的发射峰、较大的斯托克斯位移和长的荧光寿命[14]、[15]，特别适合作为标记材料。研究表明，基于夹心格式的荧光微球免疫层析试纸条（FM-ICTS）对大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度比传统胶体金基试纸条高8倍[16]。然而，对于SEB的检测，这些LFIA平台主要依赖多克隆（pAbs）和单克隆抗体（mAbs），由于天然Fc片段的存在，这些抗体在复杂样品基质中容易稳定性不足和非特异性结合，从而导致假阳性结果[17]。这些限制共同影响了检测方法的灵敏度和可靠性。因此，开发结合高亲和力、强特异性、稳健稳定性和优异抗干扰能力的新识别元件对于提高LFIA性能至关重要[18]、[19]。
纳米体（Nbs），也称为单域抗体片段，天然存在于骆驼科动物的血清中，仅由重链抗体的抗原结合域组成[20]，保留了与传统抗体相当的高亲和力，同时具有小分子尺寸、易于表达、稳定性增强和低成本生产等显著优势[21]、[22]。它们延长的互补决定区3（CDR3）有助于识别隐蔽表位，并允许进行直接的蛋白质工程[23]、[24]。高亲和力纳米体可通过噬菌体展示技术高效分离。对这些分子的后续工程化使其在免疫测定和生物传感器中得到广泛应用，显示出在检测毒素、病原体和农药残留方面的巨大潜力。
利用预先建立的针对SEB的噬菌体展示纳米体库，通过多轮生物淘选分离出高亲和力纳米体。随后，创新性地构建了带有Avi标签的纳米体（Nb-Avi）和碱性磷酸酶融合的纳米体（ALP-Nb）以筛选纳米体对。通过一步法夹心化学发光免疫测定（SCLIA）确定了最优纳米体对，该方法可实现纳米体的定向固定并一步输出检测信号。随后，开发了一种基于这种最优纳米体对的时间分辨荧光免疫层析试纸条，用于快速检测SEB。在组装过程中，选择了与硝酸纤维素（NC）膜兼容的纳米体融合蛋白，并采用位点特异性标记技术将纳米体高效结合到荧光微球上。经过系统优化后，所建立的测定方法可在15分钟内完成检测，检测限为0.034 ng/mL，线性范围为0.10-6.3 ng/mL，优于大多数报道的免疫测定方法。此外，由于纳米体中不含Fc片段，所开发的试纸条对蛋白A的干扰具有出色的抵抗力。在实际样品应用中，该方法表现出高准确性、优异的特异性和出色的稳定性，回收率在84.40%至114.21%之间。总之，这项工作提供了一个基于双纳米体的稳健技术平台，实现了SEB的快速和高灵敏度检测，显示出在现场筛查和食品安全监测中的巨大应用潜力。
材料与试剂
葡萄球菌肠毒素B（SEB）购自上海浩阳生物技术有限公司。分子生物学试剂，包括限制性内切酶Xma I和Kpn I-HF、T4 DNA连接酶和Q5高保真DNA聚合酶，从New England Biolabs有限公司（北京，中国）获得。辅助噬菌体M13KO7来自Booyoux（北京）生物技术有限公司。Trans5α和TransB(DE3)化学感受态细胞购自TransGen Biotech有限公司（北京，中国）。
抗SEB纳米体的筛选
使用噬菌体展示技术进行了四轮生物淘选。富集曲线（图S1A）表明，在三轮淘选后，特定噬菌体克隆得到了有效富集并成为优势克隆，证实了筛选的成功。对于初步筛选，从第三轮和第四轮中选取了96个单独的克隆进行噬菌体ELISA分析（图S1B）。信号更强的克隆进一步得到了验证（图1B）。OD450比值（SEB组 vs. BSA对照）范围为1.1至6.0；16
结论
本研究旨在开发高灵敏度和快速的葡萄球菌肠毒素B（SEB）检测方法。利用噬菌体展示技术，我们从抗SEB库中分离出一组高亲和力和特异性的纳米体。这些纳米体解决了传统抗体的局限性，如稳定性不足、配对效率和抗干扰能力差等问题。为了确定一步法夹心化学发光免疫测定（SCLIA）的最佳纳米体对，我们构建了纳米体
CRediT作者贡献声明
孙铁强：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、形式分析、概念构思。罗晨：研究。沈志强：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目管理、资金获取、概念构思。毛玉琳：研究。卢志龙：研究。侯健：研究。龚婷婷：验证、方法学、研究、数据管理。郝正：撰写 – 审稿与编辑、撰写 –
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
数据可用性
本研究生成和分析的所有数据均包含在本文和补充文件中。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢所有为这篇手稿付出努力的同事。本研究得到了国家自然科学基金（批准号：82204046）的支持。
