单次注射长效重组FSH进行牛卵巢刺激和卵子采集的会阴部中胚层疗法：新型“1,2---3GO”方案

《Animal Reproduction Science》：Single-injection vulvar mesotherapy of long-acting recombinant FSH for ovarian stimulation and ovum pick-up in cattle: The novel “1,2---3GO” protocol

本研究开发了一种新型牛卵巢刺激方法，通过单次阴道局部注射长效重组FSH（LArF-VM），剂量优化为150μg。结果显示，LArF-VM在卵泡数量、中卵泡比例及卵子回收率上显著优于传统多注射方案（SApF-IM），同时减少操作次数、注射时间和成本，且不影响最终产卵效果。该方案具有操作简便、动物福利改善及经济效益高等优势。

　　

Muhammad Shahzad|Hubdar Ali Kolachi|Jesse Oluwaseun Ayantoye|Xiaomeng Zhang|Gui-li Xu|Pengcheng Wan|Xueming Zhao

中国农业科学院动物科学研究所（IAS），中国北京市海淀区圆明园西路2号，邮编100193

摘要

会阴部皮下注射（vulvar mesotherapy）通过“首过效应”实现向生殖道的靶向药物输送。我们通过会阴部皮下注射人源长效重组卵泡刺激激素（LArF）来刺激预同步化的荷斯坦奶牛的卵巢。我们将单剂量LArF皮下注射方案与传统的多剂量短效猪垂体FSH（SApF-IM）肌肉注射方案进行了比较。研究目的是优化LArF皮下注射剂量，验证其相对于传统方案的有效性，并评估操作效率、成本和动物福利。在剂量优化实验中（n = 20），150 μg LArF皮下注射组的总卵泡数（18.6 ± 3.84个）、中等大小卵泡数（12.8 ± 2.78个）和回收的卵母细胞数（15.6 ± 2.70个）显著高于100 μg LArF皮下注射组或SApF-IM组（P ≤ 0.05）。150 μg剂量在卵母细胞回收方面表现最佳，且卵泡分布更理想（小卵泡21.74%，中等大小卵泡69.57%，大卵泡8.70%），而SApF-IM组分别为10.77%、49.23%、40%（P ≤ 0.05）。LArF皮下注射方案还显著减少了处理次数、注射时间、稀释剂用量以及每头供体奶牛的劳动力成本（P ≤ 0.01）。验证实验（n = 13）显示，LArF皮下注射组和SApF-IM组在卵泡反应（22.17 ± 7.9 vs 21.71 ± 9.4）和卵母细胞产量（15.67 ± 6.02 vs 15.86 ± 7.15）方面没有显著差异（P > 0.05）。单剂量LArF皮下注射方案为卵母细胞采集提供了一种更简单、更安全、压力更小、物流更优且更具成本效益的方法，同时仍能维持有效的卵泡刺激和卵母细胞回收。

引言

动物福利正成为可持续未来养牛业的核心支柱。“养殖的社会许可”概念（Coleman, 2018）将动物福利与气候变化、水资源短缺、环境退化和生物多样性下降等全球性问题联系起来（del Campo et al., 2025）。因此，养牛项目迫切需要创新的繁殖技术以满足未来农业的标准。尽管传统的多剂量猪垂体FSH注射方案在压力大、劳动强度高、物流要求高且存在生物安全风险（Frata et al., 2025）的情况下，仍被广泛用于卵巢刺激和体外胚胎生产（OPU/IVEP）。在欧洲（88%）和北美（69.2%），由于主要是牛（Bos taurus）的饲养，这种方案更为常用（Sarwar et al., 2020）。这些传统制剂主要来源于屠宰动物的垂体（Chupin and Procureur, 1983; Wu et al., 1993）。由于FSH的半衰期仅为5小时（Demoustier et al., 1988, Vieira et al., 2016），需要在卵泡发育期间多次注射以维持阈值浓度并促进多个卵泡的生长（Frata et al., 2025）。窦卵泡的存活依赖于FSH浓度和注射频率（Bó and Mapletoft, 2020），而较高剂量可提高卵母细胞回收率和胚胎产量（Motta et al., 2023）。由于半衰期短，传统方案需要给每头供体奶牛注射八次，导致多次处理（Yilmaz et al., 2025）。频繁的处理对动物和操作人员造成压力（Biancucci et al., 2016），增加技术错误风险（Deguettes et al., 2020），并提高劳动力和技术成本。制剂通常需要大量稀释剂（10 mL），且FSH与LH的比例不一（D’Alessandro et al., 2005），这可能导致刺激和资源浪费（Ireland et al., 2025, R?gener, 2024）。减少处理次数可以提高动物福利和生产力（Grandin, 1998）。因此，简化卵巢刺激方案对于提高其便利性、可行性和效果至关重要。

随着生物工程的进步，重组FSH（rFSH）现已可用于兽医领域（Lispi et al., 2023）。其延长的半衰期有助于维持阈值浓度并防止卵泡闭锁（Jung et al., 2014）。与FSH不同，rFSH不含黄体生成素（LH），从而降低了过早黄体化的风险（Abreu et al., 2024, Mannaerts et al., 1991）。单次注射LArF即可刺激奶牛的多个卵泡发育（Sanderson and Martinez, 2020），且人用rFSH在牛中的繁殖效果令人满意（de Moura et al., 2024, Khodadadi et al., 2022, Viana et al., 2024）。一种源自中国的新型人用LArF（XOO2）具有延长的体内半衰期（Xu et al., 2023）。因此，我们旨在通过使用LArF来减少注射次数。

除了激素制剂外，给药途径也会影响药物输送效率和组织分布。通常，FSH通过肌肉注射（IM）和皮下注射给药，也有静脉注射和脊髓注射的案例（Farin et al., 2008, Sakaguchi et al., 2018）。传统途径会导致药物在到达卵巢前全身分布（Hsu et al., 2008），可能产生非靶效应（如脂肪组织、肝脏、骨骼和胰腺）（Cheng et al., 2023, Sun et al., 2020）。阴道给药等替代途径在人类和牲畜的繁殖应用中获得了广泛认可，由于具有专门的血管网络，可实现向生殖道的靶向输送（G?k et al., 2016, Mirza et al., 2016, Sanchez Armengol et al., 2025）。阴道途径可通过“首过效应”直接作用于卵巢（Hsu et al., 2022, Subi et al., 2024）。皮下注射法具有缓慢且持续的释放特性，相比其他途径疼痛和刺激更小（Hsu et al., 2011, Hsu et al., 2009, Hsu et al., 2008）。研究表明，LArF的会阴部皮下注射可减少患者的注射次数和不适感（Hsu et al., 2021）。我们假设LArF的会阴部皮下注射可以在奶牛中以最小的注射量和处理次数实现卵巢刺激。

此前尚未有研究探索这种LArF皮下注射方案在奶牛中的应用。因此，我们旨在开发一种简化方案，使用单剂量LArF通过会阴部皮下注射进行卵巢刺激，与传统的多剂量短效猪垂体FSH肌肉注射方案进行比较。

研究目标：

• 优化预同步化荷斯坦奶牛中基于LArF皮下注射的卵巢刺激方案剂量
• 评估新型LArF皮下注射方案对动物处理（福利）、工作日、注射时间、注射稀释剂用量和劳动力成本的影响，同时确保有效的卵巢卵泡发育和卵母细胞回收
• 验证优化后的LArF剂量相对于传统SApF-IM方案的疗效

材料与方法

本研究已获得中国农业科学院北京分院研究伦理委员会的严格审查和批准（批准编号：2024/08/21）。

剂量优化实验

150 μg LArF皮下注射组的总窦卵泡数和回收的卵母细胞数显著高于100 μg LArF皮下注射组及传统SApF-IM组（图3，表1；P ≤ 0.05）。150 μg剂量组的中等大小卵泡数也显著高于100 μg剂量组和SApF-IM组，但与200 μg剂量组无显著差异（P > 0.05）（图3，表1）。然而，两组的总卵泡数无显著差异

讨论

长效重组FSH（LArF）可在减少注射次数的同时维持最佳的FSH水平。会阴部给药可能为生殖系统的“首过效应”提供理想的注射部位（Hsu et al., 2011, Hsu et al., 2009, Hsu et al., 2008）。据我们所知，此前尚未有关于LArF会阴部皮下注射在奶牛中的相关研究。我们致力于开发一种简化、压力更小且效率更高的方案

结论

会阴部皮下注射是实现奶牛长效重组FSH持续输送的有效途径。基于“首过效应”，本研究成功开发了一种新型的“1,2---3GO”卵巢刺激方案，仅使用150 μg剂量的长效重组FSH（XOO2）通过会阴部皮下注射。该方法实现的卵泡发育和卵母细胞回收效果与传统八次注射短效垂体FSH方案相当

未引用参考文献

(One Health, n.d, SDG 6-UN, n.d)

作者贡献声明

SHAHZAD MUHAMMAD：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件使用、方法论设计、数据分析、概念构建。Hubdar Ali Kolachi：撰写——审阅与编辑、数据管理。Jesse Oluwaseun Ayantoye：撰写——审阅与编辑。Xueming Zhao：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调、项目管理、方法论设计、数据分析、概念构建。Gui-li Xu：资源协调。Pengcheng Wan：撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

所有作者均声明无利益冲突

致谢

作者声明本研究及文章的发表获得了财政支持。该工作得到了国家重点研发计划（2022YFE0100200）、国家自然科学基金（32161143032）、新疆天池人才计划专项（Xueming Zhao）、CARS专项（CARS36-16）以及国家家畜种质资源中心的资助