《Infection and Immunity》：The Leptospira immunoglobulin-like protein LigB from Leptospira borgpetersenii serovar Arborea is not required for either acute or chronic infection
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本研究针对致病性钩端螺旋体（Leptospira spp.）中关键的表面膜蛋白——钩端螺旋体免疫球蛋白样蛋白（Lig）家族的功能存在争议。为探究在缺失LigA的波氏钩端螺旋体（L. borgpetersenii）中，LigB是否仍为关键的毒力因子，研究者利用CRISPR-Prime Editing（CRISPR-PE）技术成功构建了LigB基因敲除突变株。结果发现，在仓鼠急性感染模型和大鼠慢性感染（肾脏定植）模型中，该突变株的毒力与野生型无异。这表明，在此特定菌株背景下，LigB对感染并非必需，挑战了LigB是普遍性毒力决定因子的传统观点，并提示Lig蛋白的功能可能存在物种/菌株特异性冗余，为理解钩端螺旋体致病机制和设计跨物种保护性疫苗提供了新视角。
钩端螺旋体病，一种由致病性钩端螺旋体引起的全球性人畜共患病，每年导致超过百万病例和数万死亡，不仅威胁人类健康，也对多种家畜和野生动物造成严重影响。在这场旷日持久的“猫鼠游戏”中，科学家们一直在努力识别致病菌身上的“武器”——毒力因子，以期找到防治的关键靶点。在众多候选“武器”中，钩端螺旋体免疫球蛋白样蛋白（Leptospiral immunoglobulin-like proteins, Lig）家族，特别是LigA和LigB，因其位于细菌表面并能与宿主多种成分相互作用，长期以来被认为是关键的“王牌”毒力因子。此前的研究表明，在问号钩端螺旋体（L. interrogans）中，同时沉默ligA和ligB会导致细菌毒力显著减弱。这似乎坐实了它们的“王牌”地位。然而，一个根本性问题悬而未决：在其他种类、遗传背景不同的致病性钩端螺旋体中，Lig蛋白，尤其是分布最广泛的LigB，是否依然扮演着不可或缺的角色？特别是在天生就缺乏ligA基因的波氏钩端螺旋体（L. borgpetersenii）中，孤零零的LigB是否独自挑起了致病的大梁？这个问题的答案，对于理解钩端螺旋体致病机制的多样性，以及开发具有广泛保护效果的疫苗至关重要。
为了直接回答这个问题，一项发表于《Infection and Immunity》的研究粉墨登场。研究团队选取了从美属维尔京群岛的啮齿动物中分离到的一株致病性波氏钩端螺旋体——波氏钩端螺旋体波尔托姆血清群Arborea血清型LR131菌株。这株细菌的特点是天生的“独臂侠”——它只携带ligB，不携带ligA，这为研究LigB的独立功能提供了绝佳模型。研究人员祭出了最新的基因编辑“神器”——CRISPR-Prime Editing（CRISPR-PE）技术。他们利用该技术，精准地在ligB基因的编码序列中引入了一个单核苷酸的移码缺失，从而成功构建了一个不表达LigB蛋白的基因敲除（knockout, KO）突变株。免疫印迹和DNA测序结果确凿地证实了LigB表达的完全缺失，而细菌的生长速率未受影响。随后，他们让这株“卸下”了LigB“武器”的突变菌，与携带空载质粒的野生型对照菌，在两种经典的动物感染模型中一决高下。
研究者用到的主要关键技术方法包括：利用CRISPR-Prime Editing（CRISPR-PE）技术对波氏钩端螺旋体LR131菌株的ligB基因进行精准的移码缺失突变，构建基因敲除株；通过免疫印迹和DNA测序对突变株进行表型和基因型验证；使用仓鼠急性致死感染模型（腹腔和结膜感染途径）和大鼠慢性感染与肾脏定植模型（腹腔和结膜感染途径），评估突变菌的体内毒力；通过定量PCR（qPCR）和细菌培养定量检测宿主体内（血液、肝脏、肾脏）及尿液中的细菌载量。
Construction and validation of the ligB knockout mutant in L. borgpetersenii
研究人员成功应用CRISPR-PE技术在波氏钩端螺旋体LR131菌株中构建了ligB敲除突变体。免疫印迹分析显示，经过筛选的克隆完全丧失了LigB蛋白的表达，而作为内参的LipL32蛋白表达正常。DNA测序证实，突变导致了一个核苷酸的缺失，并因此在下游引入了提前终止密码子。体外传代实验表明，该突变表型是稳定的。这些结果确凿地证明，研究人员获得了一个纯净的、不表达LigB的基因敲除株。
L. borgpetersenii lacking LigB can cause acute disease in the hamster model
在仓鼠急性感染模型中，无论是通过腹腔注射还是更接近自然感染的结膜途径接种，ligB敲除突变株与对照菌株一样，均能导致仓鼠发生急性致死性疾病。感染后动物的存活曲线、出现临床症状的时间点均无显著差异。定量分析显示，突变菌在感染早期（腹腔感染第3天）能在血液中达到与对照菌相似甚至更高的载量。在疾病终点，突变菌也能同样有效地侵袭并高水平定植于靶器官（肝脏和肾脏），其细菌载量与对照菌无统计学差异。从患病动物肝脏中分离出的细菌经测序证实仍为ligB突变基因型，排除了回复突变的可能。这些数据强有力地证明，在波氏钩端螺旋体LR131菌株中，LigB的缺失并不影响其引起急性致命感染的能力。
L. borgpetersenii lacking LigB can colonize kidneys and are excreted via urine in the rat model
在大鼠慢性感染与肾脏定植模型中，ligB敲除突变株同样表现出与野生型菌株相似的致病能力。无论通过腹腔还是结膜途径感染，突变菌都能成功地在大鼠肾脏中建立长期定植，并随尿液持续排出，排菌模式（细菌数量随时间的变化）与对照菌基本一致。通过暗视野显微镜观察和qPCR检测，在感染后数周内的尿液样本中，均可检测到活的、有动力的突变钩端螺旋体，且载量与对照组相当。在实验结束时（第7周），从感染突变菌的大鼠肾脏中均能成功培养出细菌，且经测序确认其基因型仍为ligB敲除型。这些结果表明，LigB的缺失并不影响波氏钩端螺旋体建立慢性肾脏感染和经尿排菌的能力，这是其在自然宿主中持续存活和传播的关键环节。
DISCUSSION
研究的讨论部分对结果进行了深入阐释，并指出了其重要意义。首先，这项工作首次在波氏钩端螺旋体这一重要致病菌种中，实现了对ligB基因的靶向敲除，这本身就得益于CRISPR-PE等新型遗传操作工具的应用，突破了以往功能基因组学研究多局限于问号钩端螺旋体的瓶颈。
核心结论是明确的：在波氏钩端螺旋体LR131菌株的遗传背景下，LigB对于其在仓鼠模型中引起急性疾病，以及在大鼠模型中建立慢性肾脏感染和经尿排菌，都是“非必需的”（dispensable）。这一发现挑战了基于问号钩端螺旋体研究形成的认知——即LigA和LigB是关键的毒力因子，且同时缺失会导致毒力减弱。本研究提示，Lig蛋白作为毒力因子的重要性可能具有物种或菌株特异性。
对于为何在缺乏LigA的LR131菌株中，单独敲除LigB仍不影响毒力，作者提出了两种可能解释。第一种可能是，LigB本身在此菌株背景下的致病过程中就不起作用。第二种，也是更被作者倾向的一种可能是，该菌株中存在的另一个Ig样结构域蛋白（与问号钩端螺旋体的LigC有88%相似性）可能发挥了功能补偿作用。在问号钩端螺旋体中，当ligA和ligB同时被沉默时，即使存在完整的ligC基因，毒力也会减弱，这表明LigC的补偿能力有限。然而，在波氏钩端螺旋体中，这种同源蛋白（可称为LigC样蛋白）与LigB的功能重叠性可能更高，从而足以弥补LigB缺失的功能。要验证这一假设，未来需要构建ligB和ligC样基因的双敲除突变体，或者在不携带ligC样基因的波氏钩端螺旋体哈焦血清型（serovar Hardjo）菌株中敲除ligB进行研究。
这项研究的意义重大。它强调了在评估钩端螺旋体潜在疫苗候选抗原时，必须考虑物种和遗传背景的差异。此前一些以LigB为基础的疫苗研究未能提供完全保护或防止肾脏定植，而本研究从病原体基因功能的角度为此提供了一种可能的解释——在某些菌株中，LigB可能根本就不是必需的毒力因子，因此以其为靶点的疫苗效果可能有限。这推动领域重新思考“普遍性”毒力决定因子的概念，并指出未来需要致力于鉴定在不同致病性钩端螺旋体物种中都保守且必需的“核心”毒力因子，这对于开发广谱有效的钩端螺旋体病亚单位疫苗具有关键的指导价值。
