《Journal of Clinical Microbiology》：High-throughput multiplex detection of respiratory pathogens: multicenter evaluation of the NxTAG Respiratory Pathogen Panel v2 assay
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为了解决呼吸道感染快速精准诊断的临床需求，研究人员对更新的NxTAG?呼吸道病原体检测板v2（RPPv2）开展了多中心临床与性能评价。该研究证实，该检测板可一次性精准检出21种呼吸道病原体，具有高准确性（大多数靶标阳性符合率PPA≥95%）、高重现性（99.9%）和高通量操作优势，为呼吸道感染的快速诊断、抗生素合理使用和感染控制提供了高效工具。
当我们感冒、发烧、咳嗽时，第一时间想知道的往往是：我到底感染了什么？是病毒还是细菌？这个问题的答案直接决定了医生是该开抗生素，还是进行抗病毒治疗或采取隔离措施。呼吸道感染（Respiratory Tract Infections, RTIs）是全球范围内导致门诊就诊、住院和抗生素处方的最常见原因之一，不仅给个人健康带来威胁，也造成了巨大的医疗负担。然而，不同病原体（包括病毒和细菌）引起的呼吸道感染症状常常重叠，仅凭临床表现很难准确区分，这给临床诊断和治疗带来了巨大挑战。传统的病原体检测方法往往一次只能检测一种或少数几种病原体，耗时长且可能漏检。在流感高发季或新冠（COVID-19）大流行期间，对能够快速、同时检测多种病原体的技术的需求尤为迫切。
分子诊断技术的出现，特别是基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）的多重检测平台，已经改变了呼吸道病原体检测的格局。这些被称为多重呼吸道检测板（Multiplex Respiratory Panels, MRPs）的技术，可以在单次检测中同时筛查十几种甚至几十种常见的病毒和细菌。它们能够快速明确感染病因，从而帮助减少诊断的不确定性、避免不必要的抗生素使用、优化患者隔离并加强感染控制。市场上已有多种商业化的MRPs，而更新的NxTAG?呼吸道病原体检测板v2（RPPv2）在原有版本基础上，进一步扩展了病原体覆盖范围并优化了工作流程。
为了评估这款更新版检测板的真实表现，一项由Luminex公司资助的多中心研究在美国的五家临床机构展开。这项研究旨在全面评价NxTAG RPPv2检测21种病毒和细菌性呼吸道病原体的临床和分析性能，并将其与已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的分子检测方法以及双向测序（Bidirectional Sequencing, BDS）进行对比。研究成果最终发表在了微生物学领域的权威期刊《Journal of Clinical Microbiology》上。
研究人员为开展此项评价，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，他们构建了一个包含2145份鼻咽拭子（Nasopharyngeal Swab, NPS）标本的研究队列，其中包括前瞻性收集的新鲜标本和存档的冷冻标本，以评估检测在不同样本状态下的性能。其次，研究采用了标准化的核酸提取平台（如bioMérieux eMAG和easyMAG）对标本进行处理。核心检测技术即本研究评价的对象——NxTAG RPPv2检测，该技术基于微珠杂交原理，在MAGPIX系统上实现闭管、高通量的多重PCR（Polymerase Chain Reaction）检测。为了验证结果，研究将NxTAG RPPv2的检测结果与各参与实验室使用的“标准诊疗”（Standard of Care, SoC）分子检测方法的结果进行比较，并对所有不一致的结果以及部分特定靶标（如甲型流感H1亚型分型）使用金标准——双向测序（Bidirectinal Sequencing, BDS）进行最终裁定。此外，针对临床标本中阳性率较低的特定病原体（如肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒B型等），研究还制备了人工加标的模拟标本，用于补充评估检测的分析性能。最后，通过多中心、多操作员、多日的重现性实验，并计算阳性符合率（Positive Percent Agreement, PPA）、阴性符合率（Negative Percent Agreement, NPA）等统计指标，全面评估了该检测的准确性与可靠性。
研究结果
人口统计学、标本和无效结果
研究共纳入了2145份临床标本。首次检测的有效结果为98.97%，经单次复检后，有效结果率提升至99.72%。标本主要来自急诊科患者，人口统计学特征涵盖了不同年龄和性别的群体。
提取平台比较
研究同时使用了easyMAG和eMAG两种核酸提取平台。分析显示，两种平台处理的标本在临床性能上没有显著差异，表明NxTAG RPPv2与这两种常用提取平台兼容性良好。
准确性
这是本研究最核心的部分，详细评估了NxTAG RPPv2对每个靶标病原体的检测性能。
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前瞻性标本：在病毒靶标中，18个靶标里有15个达到了PPA ≥95%（甲型流感H1亚型未获得临床阳性标本）。腺病毒、甲型和乙型流感、冠状病毒OC43和229E、鼻病毒/肠道病毒、呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV）A/B型等均表现出很高的符合率（PPA 95.1%-100%）。较低的PPA值出现在冠状病毒HKU1、NL63和副流感病毒4型。对于SARS-CoV-2，PPA为97.9%，NPA为99.3%。对于细菌靶标，肺炎衣原体和肺炎支原体均显示100%的NPA，但前瞻性标本中未检出阳性。所有靶标的NPA均≥99.2%。此外，检测还在125份标本中发现了多重病原体感染（以双重感染为主），与比较方法的一致性为84.8%。
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存档标本：在存档标本组中，NxTAG RPPv2同样表现出高准确性。对于大多数有足够阳性标本的靶标，PPA很高（通常为100%），NPA也 consistently很高（通常≥99%）。
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模拟标本：为补充低流行率靶标而制备的模拟标本结果显示，除RSV B型和肺炎衣原体的PPA为98%外，其他所有靶标的PPA均为100%，NPA也均接近100%。
与标准诊疗检测的比较
NxTAG RPPv2的检测结果还与参与实验室各自使用的、涵盖12个制造商共21种不同检测的SoC方法结果进行了比对。在所有靶标上，NxTAG RPPv2相对于SoC检测都表现出高的PPA（92.3%–100%）和NPA（99.5%–100%），不一致结果已通过NxTAG RPP和双向测序进行裁定。
重现性
一项在多中心开展的重现性研究评估了NxTAG RPPv2在不同检测点、操作员、日期和仪器间的一致性。结果显示，该检测的总体符合率达到99.9%，证明了其卓越的操作稳定性和结果可重复性。
研究结论与讨论
本研究系统评估表明，NxTAG RPPv2检测板在检测21种病毒和细菌性呼吸道病原体方面，具有高准确性、高重现性和高可靠性。其广泛的病原体覆盖范围、区分RSV A/B亚型的能力、高通量工作流程以及在新鲜和冷冻标本中一致的表现，使其成为呼吸道感染常规诊断的一个实用解决方案。
研究人员在讨论中指出，NxTAG RPPv2是原有NxTAG RPP检测板的改进版本，主要修改包括增加了甲型流感和甲型流感H3亚型的引物以提升覆盖率，调整了人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒的引物以提升特异性，并新增了SARS-CoV-2这一重要靶标。与比较方法相比，各靶标的检测限（Limit of Detection, LoD）相当或更具优势。该检测观察到的11.3%的多重感染率与已报道的数据相符，反映了呼吸道感染的复杂病因。
尽管在极少数靶标（如副流感病毒4型）上观察到较低的PPA，分析认为这可能与病原体载量低、接近检测限、病毒遗传变异或多重PCR中的竞争性抑制等因素有关。研究人员通过生物信息学分析预测，该检测对当前流行的冠状病毒HKU1和甲型流感H1pdm09毒株的覆盖率分别约为99%和96%，表明其引物设计具有广泛的包容性。文章也明确指出，检测结果不应作为诊断、治疗或患者管理的唯一依据，需结合临床表现和其他检查进行综合判断。
从操作层面看，NxTAG RPPv2结合eMAG/easyMAG提取平台，提供了许多竞争系统所不具备的高通量选择。虽然需要前置的核酸提取步骤，但其下游工作流程为闭管操作，高效且手工操作时间短，一次最多可处理96份标本，在提取后约3小时内即可完成，在通量上具备显著优势。
该检测的重要意义远超单纯的病原体鉴定。它能快速鉴别细菌性与病毒性感染，从而直接助力抗菌药物管理，最大限度地减少不必要的抗生素暴露，降低不良反应并遏制抗菌素耐药性。同时，快速明确病原体有助于及时实施精准的感染控制措施，防止院内传播。此外，其高通量、广覆盖的特点，使其非常适用于呼吸道疾病暴发期间的应急检测和病原体流行监测，能为公共卫生应对提供实时、可操作的数据。
总之，NxTAG RPPv2检测板凭借其优异的综合性能，为提升患者诊疗水平、加强呼吸道病原体监测和改善疫情应对准备提供了一个有价值的工具。随着呼吸道疾病谱的不断演变，这类灵活、可靠的症候群检测平台将在及时诊断、有效临床管理和人群水平监测中发挥越来越关键的作用。
