《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Differential lipid dynamics regulation by sterols in ceramide and sphingomyelin containing membranes
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膜脂质组学研究中胆固醇及代谢物对SM/Cer膜动力学的影响差异及其氢键机制分析
耶稣·阿亚拉-桑马丁（Jesus Ayala-Sanmartin）|安东宁·拉马齐埃（Antonin Lamazière）
法国巴黎索邦大学INSERM圣安托万研究中心（CRSA），UMRS 938项目
摘要
在过去二十年里，胆固醇在膜脂质组织和排列中的作用已经得到了充分证实。然而，胆固醇前体及其他胆固醇衍生物在调节细胞膜物理化学性质方面的作用则研究较少。本文研究了胆固醇、两种胆固醇前体（脱甲基胆固醇和羊毛甾醇）以及两种羟基化代谢物（24S-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇）对膜动态的影响。通过模拟血浆膜的模型，比较了含有鞘磷脂和神经酰胺的膜之间的差异。我们使用了两种荧光探针来研究脂质有序性和分子流动性：Laurdan用于检测脂质头部附近的极性和有序性，而胆固醇-芘探针则用于检测膜中心区域的有序性。实验结果表明，脱甲基胆固醇尾部的双键改变了双层中心附近的分子动态，导致神经酰胺膜的有序性低于鞘磷脂膜。羊毛甾醇环上的甲基基团增加了脂质头部的极性并降低了有序性；而24和25位碳上的羟基基团则以复杂的方式改变了膜沿轴线的性质。这些结果表明，神经酰胺和鞘磷脂与特定固醇之间的分子内和分子间氢键能力差异，是导致膜性质特定变化的部分原因。
引言
细胞膜是由数百种分子脂质和大量（通常经过糖基化的）蛋白质组成的复合结构。在哺乳动物的血浆膜中，细胞外层富含磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）和胆固醇（Chol）。这种组成促进了横向异质性，使脂质能够分离成具有不同物理化学性质的域。胆固醇在这一过程中起着核心作用：它通过凝聚和排列饱和酰基链（尤其是在富含SM的环境中），调节双层厚度、紧密度和通透性，并稳定液态有序（Lo）域，这些有序域与蛋白质功能密切相关（参见相关综述）。
除了作为结构支架外，胆固醇及其代谢衍生物还充当细胞生理的双功能调节因子。从结构上看，固醇可以调节膜材料的性质（如有序性、表面张力和曲率弹性），从而影响膜蛋白的排序、扩散和构象。此外，某些固醇和氧固醇还作为信号分子，与核受体（如LXR）、G蛋白偶联受体及其他传感器结合，调控脂质代谢、炎症和神经元稳态。
因此，胆固醇生物合成或代谢的紊乱会带来双重后果：膜生物物理性质的改变和信号传导的紊乱，这些变化具有临床意义。例如，脱甲基胆固醇（DS）与阿尔茨海默病有关[4]，以及先天性代谢异常脱甲基胆固醇症[5]；羊毛甾醇（LN）可降低晶状体混浊的风险[6]；而脑源性氧固醇24S-羟基胆固醇（24OH）——这种能够促进胆固醇跨血脑屏障转运的关键配体——在亨廷顿病中含量减少[7][8]，并在小鼠模型中恢复其含量后改善了运动表现[9][10]。这些观察结果强调了研究用特定前体或代谢物（如DS、LN、24OH）替代胆固醇如何重塑膜域的形成、紧密度和力学特性的必要性。通过对这些“胆固醇代谢物”在可控的PC/SM/固醇模型膜中的系统生物物理表征，可以深入了解其作用机制，并为靶向治疗策略的开发提供依据。
根据物理化学性质，血浆膜域可分为两类：富含胆固醇和饱和酰基链的液态有序（Lo）域，以及富含不饱和酰基链的液态无序（Ld）域。Ld域被认为更具“流动性”，而Lo域则更“刚性”。它们的物理化学性质（如脂质有序性、紧密度和水通透性）对细胞功能的调节至关重要。已有研究探讨了胆固醇在脂质重排、横向分离和膜性质中的作用（参见相关综述[11]）。例如，胆固醇可以诱导并稳定膜域分离，增加脂质有序性和膜厚度[13][14]（无论是在模型膜还是生物膜中）。
鞘磷脂，尤其是鞘磷脂，也参与膜域的形成[12]。富含胆固醇和鞘磷脂的膜域被称为“筏状结构”。一般来说，胆固醇会增厚膜；然而，在含有50%胆固醇的C18:0纯鞘磷脂中观察到胆固醇会使其变薄[16]。神经酰胺（Cer）既是鞘磷脂的前体，也是其衍生物（当鞘磷脂酶切割鞘磷脂的胆碱头部时产生）。神经酰胺参与信号通路、炎症和细胞存活过程，同时对膜域的形成和筏状结构的稳定也起着重要作用（参见综述[18][19]及其中的参考文献）。Cer可以调节膜酰基链的有序性并促进域的分离，这些效应受温度和胆固醇浓度的影响[20][21]。有人提出，Chol和Cer对SM的竞争以及存在不同类型的SM/Cer、SM/Chol和Cer/Chol膜域，表明这些膜域的存在取决于不同的脂质浓度[20]。
在之前的研究中[22]，我们比较了胆固醇（Chol）、羊毛甾醇（LN）、脱甲基胆固醇（DS）以及24S-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇（24OH、25OH）对模拟Lo域和Ld域的膜极性、有序性、脂质紧密度和流动性的影响；虽然酰基链组成存在差异，但膜头部（胆碱）保持不变。研究结果表明：首先，每种固醇都会特异性地改变膜性质；其次，不同固醇在Lo域和Ld域中的效应不同（PC/固醇或SM/固醇）；第三，固醇引起的变化强度取决于测量位置是在膜头部还是双层中心，这是通过两种不同的荧光探针来确定的。
本研究重点关注鞘磷脂头部及其与固醇的关系。我们通过比较含有相同酰基链组成但头部化学性质、大小和氢键能力不同的卵鞘磷脂（SM）和卵神经酰胺（Cer）膜，来研究鞘磷脂头部的作用。我们研究了不同固醇对这些膜的影响：胆固醇（Chol）、羊毛甾醇（LN）（胆固醇合成途径中的第一个多环前体）、脱甲基胆固醇（DS）（Bloch途径中的最后一个前体），以及两种羟基化衍生物24S-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇（24OH、25OH）（图1A）。如前所述[22]，使用Laurdan探针检测双层极性头部附近的膜性质。Laurdan的荧光参数与极性、流动性、膜有序性和脂质紧密度相关[23]。最近的研究[24]表明，GP参数与水合基团的流动性有关，胆固醇促进两种偶极松弛状态，这可以通过So/Sd比率来监测（第2.3.2节）。另一种探针是Py-met-chol（CholPy）[25][26]，它在Lo域中富集，其芘部分位于膜中心。该探针还可以通过芘激元信号检测液态有序和液态无序状态、膜极性以及胆固醇的聚集[28][29]（图1B）。
本研究结合了Laurdan（界面/甘油骨架区域）和CholPy（膜核心区域）两种探针，对膜动态进行了深度分析。这一双探针策略揭示了两个重要现象：首先，含有SM和Cer的膜在界面动力学与疏水核心动力学之间存在解耦。SM和Cer之间的差异可归因于它们各自的分子内和分子间氢键，以及能够影响双层中心和膜水界面的特定固醇基团。
材料
卵鞘磷脂（SM）、卵神经酰胺（Cer）、卵磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）、24S-羟基胆固醇（24OH）、25-羟基胆固醇（25OH）、脱甲基胆固醇（DS）和羊毛甾醇（LN）均购自Avanti Polar公司。卵鞘磷脂和卵神经酰胺的平均酰基链组成分别为：86%的16:0、6%的18:0、3%的22:0和3%的24:1；卵磷脂酰胆碱的组成分别为：33%的16:0、32%的18:1、17%的18:2和12%的18:0。Pyrene标记的胆固醇（CholPy）来自两种来源：
结果
血浆膜的细胞外层使用天然来源的磷脂进行建模，这有助于研究含有不同酰基链的膜的物理化学参数。我们研究了不同固醇对含有卵磷脂酰胆碱/卵鞘磷脂/胆固醇（PC/SM/sterol）和卵神经酰胺/胆固醇（PC/Cer/sterol）的膜性质的影响。
讨论
细胞功能与膜域的生物物理状态紧密相关。胆固醇可调节多种关键参数，包括界面极性、脂质紧密度、水通透性和分子有序性。在之前的研究中[22]，我们比较了液态有序（Lo）相和液态无序（Ld）相中固醇的效应。
在此研究中，我们进一步扩展了这一分析，比较了胆固醇与其他四种固醇的影响，并量化了它们的作用。
结论
在PC/SM和PC/Cer双层中，胆固醇均表现出全局性的有序/凝聚效应——表现为Lo域特征的增强和GP值的升高（界面极性/水合度的降低）。不同脂质类别之间的主要差异体现在Laurdan的流动性上：在20°C时，Cer膜的流动性增加，而在37°C时，SM膜的流动性降低。这些差异与不同的氢键网络有关——胆固醇-SM相互作用主要涉及磷酸基团，而Cer则通过其他方式形成氢键。
CRediT作者贡献声明
耶稣·阿亚拉-桑马丁（Jesus Ayala-Sanmartin）： 负责撰写、审稿和编辑、初稿撰写、方法验证、实验设计、数据分析、概念构思。安东宁·拉马齐埃（Antonin Lamazière）： 负责撰写、审稿和编辑、结果验证、软件使用、资源协调、项目管理、资金申请、数据管理及概念构思。
资助
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。
利益冲突声明
我们没有任何需要声明的利益冲突。
致谢
我们感谢法国图卢兹的安德烈·洛佩兹（André Lopez）博士赠送的胆固醇-芘探针。
