《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Purification and structural characterization of the tularemia membrane protein virulence factors CapB and CapC
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研究首次通过重组表达和纯化技术解析了土拉伦斯菌CapB和CapC蛋白的结构，发现它们分别形成单体和五聚体，具有α螺旋结构，并通过膜互作建模预测了跨膜螺旋数目，为后续研究该复合物的功能及靶向治疗奠定基础。
M. Eranjalee Ranaweera | Rebecca J. Jernigan | Krisha S. Boradia | Kelli L. Trimble | Vasiliy A. Loskutov | Jose M. Martin-Garcia | Lynn Goss Schrag | Felicia M. Craciunescu | Timothy L. Karr | Krishna Parsawar | Ning Zhang | Debra T. Hansen | Petra Fromme
应用结构发现中心，生物设计研究所，亚利桑那州立大学，坦佩，AZ 85287，美国
摘要
Francisella tularensis（土拉菌）是导致土拉病的病原体，它依赖于CapBCA膜蛋白复合体来在细胞内存活并发挥毒力，但其任何组成部分都尚未进行结构表征。在这里，我们报道了使用N端PelB-MBP融合策略成功表达、定位到膜上并纯化了来自F. tularensis SCHU S4的CapB和CapC蛋白。这两种蛋白都被高效地输送到了大肠杆菌的内膜中，在β-DDM去污剂中溶解，并以单分散形式纯化，每4升培养物可获得约5毫克的产量。尺寸排阻色谱、蓝色天然PAGE电泳、动态光散射和负染色电子显微镜的结果一致表明，带有麦芽糖结合标签的CapB和CapC各自形成了由去污剂稳定的寡聚体。圆二色光谱显示这两种蛋白主要具有α-螺旋二级结构，并且对离子强度的敏感性不同。使用AlphaFold 3进行的结构预测以及膜相互作用建模表明，CapB含有一个跨膜螺旋，而CapC含有五个跨膜螺旋，这与它们的疏水性特征相符。这些结果提供了CapB和CapC的首次生化和结构表征，为未来高分辨率研究CapBCA复合体及其在F. tularensis毒力中的作用以及潜在的治疗靶点提供了基础。
缩写说明
| AEBSF | 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐 |
| DE | 去污剂提取物 |
| DI | 去污剂不溶性物质 |
| DLS | 动态光散射 |
| GOR IV | Garnier–Osguthorpe–Robson IV二级结构预测方法 |
| IM | 内膜 |
| IMAC | 固定化金属亲和层析 |
| i-TASSER-MTD | 迭代穿线组装精炼 – 基于蒙特卡洛树的穿线方法 |
| IVT-HMB | 使用疏水性磁珠的体外翻译
| MBP | 麦芽糖结合蛋白 |
| MEMEMBED | 膜嵌入预测工具；OM，
关键词
蛋白质转运
电子显微镜
土拉病
CapBCA
外膜蛋白
多蛋白复合体
CapB和CapC的二级结构分析
使用PSIPRED [28]对CapB天然蛋白序列进行的二级结构预测显示，在残基6–22处存在一个高度疏水的α-螺旋（图1A），这表明它可能是一个跨膜结构域。根据Teufel等人[29]最新版本的SignalP算法分析，这个跨膜结构域并非一个被切割的信号序列。与早期版本相比，SignalP 6.0能够识别两种额外的革兰氏阴性细菌信号序列。
讨论
F. tularensis的CapB和CapC膜蛋白的重组表达依赖于将它们定向表达到
大肠杆菌的细胞膜上，其中N端的PelB信号序列和/或MBP是关键因素。这个N端PelB-MBP序列基于Hilf和Dutzler [45]使用的序列，该序列使得来自变形菌
Erwinia chrysanthemi和蓝细菌
Gloebacter的五聚体配体门控离子通道能够实现膜转运和晶体结构测定。
结论
本研究在理解
F. tularensis中CapBCA毒力因子的结构方面取得了独特进展，为未来的研究奠定了基础。通过分别纯化CapB、CapC和CapA亚基，我们为组装完整的CapBCA复合体创造了条件。未来的工作，包括对整个复合体的结构研究以及潜在的共表达策略，对于揭示其功能背后的详细分子机制至关重要。
CapB和CapC蛋白序列的生物信息学分析
使用PSIPRED 4.0 [28]进行了二级结构预测。疏水性特征是通过Kyte和Doolittle疏水性图[58]生成的。CapB和CapC天然蛋白的跨膜拓扑结构是通过MEMPACK [59]和Protter [60]预测的。序列无序程度是通过PONDR-FIT [41]评估的。
表达质粒构建
CapB和CapC的基因是通过PCR从
F. tularensis菌株SCHU S4的基因组DNA中生成的，使用Bio-Rad iProof聚合酶进行扩增，并克隆到了两个
Bse载体中。
CRediT作者贡献声明
M. Eranjalee Ranaweera：撰写 – 原始草稿、方法学、实验设计、数据分析、数据管理。
Rebecca J. Jernigan：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法学、实验设计。
Krisha S. Boradia：撰写 – 审稿与编辑、实验设计。
Kelli L. Trimble：撰写 – 审稿与编辑、实验设计。
Vasiliy A. Loskutov：撰写 – 审稿与编辑、实验设计。
Jose M. Martin-Garcia：撰写 – 审稿与编辑、实验设计、数据分析、概念构建。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢亚利桑那州立大学Eyring材料中心的设施支持，该中心部分得到了
美国国家科学基金会（奖项编号：NNCI-ECCS-1542160）的资助；同时感谢
亚利桑那州立大学知识企业质谱核心设施和
亚利桑那大学分析及生物质谱核心设施（RRID:SCR_023370）提供的资源和支持。我们还要感谢Stephen A. Johnston博士和生物设计医学创新中心以及Dewight博士的帮助。
