《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms》：Transcription coactivator SAYP cooperates with transcription factor DEAF1 to mediate immune defense in
Drosophila melanogaster
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果蝇先天性免疫中，共激活因子SAYP与转录因子DEAF1相互作用，调控不同病原体感染下抗菌肽基因特异性表达。SAYP敲低显著抑制多种抗菌肽基因激活，而DEAF1影响较弱。体内分析显示SAYP缺失导致对革兰氏阳性/阴性菌感染存活率下降，且与Relish、DEAF1协同调控免疫基因表达。
Mona Ghassah|Yulia Ulianova|Konstantin I. Balagurov|Anton A. Musabirov|Lyubov Lebedeva|Yulii Shidlovskii|Zaur Kachaev
俄罗斯科学院基因生物学研究所基因表达调控实验室，Vavilov街34/5号，119334，莫斯科，俄罗斯
摘要
先天免疫是一个多层次的系统，每个阶段都在确保有效的免疫防御中起着关键作用。在染色质水平上，转录因子和共激活蛋白复合体在调节免疫反应中发挥着重要作用。在这里，我们证明了保守的转录共激活因子SAYP（Brahma染色质重塑复合体的一个组成部分）参与了黑腹果蝇的免疫反应。通过免疫沉淀实验，我们检测到SAYP与转录因子DEAF1之间的相互作用，并定位了这些蛋白质中介导它们结合的域。我们的数据显示，在大肠杆菌或黄色微球菌的免疫刺激下，SAYP和DEAF1以基因和病原体特异性的方式被招募到多种抗菌肽基因的区域。SAYP的敲低显著降低了多种抗菌肽（AMP）基因的激活，而DEAF1的敲低效果较为有限。体内分析显示，在一个低表达突变的果蝇中，完全丧失SAYP活性会显著损害对大肠杆菌感染的几种AMP基因的诱导。此外，我们发现SAYP在某些抗菌肽基因的调控区域与Relish和DEAF1合作。一致地，携带低表达SAYP突变的果蝇在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染后的存活率降低。总体而言，这些发现表明SAYP与Relish和DEAF1共同参与了一个复杂的调控机制，该机制在分子和有机体水平上控制着先天免疫反应。
引言
在黑腹果蝇中，提供第一道抵御微生物入侵者保护的先天免疫机制包括体液免疫和细胞免疫。体液免疫，也称为系统性免疫反应，其特征是分泌抗菌肽（AMPs）——这些小肽可以杀死微生物细胞以保护果蝇[1]，[2]。AMP基因的表达主要由两条NF-κB通路调节：Toll通路介导对革兰氏阳性细菌和真菌的免疫反应，IMD（免疫缺陷）通路介导对革兰氏阴性细菌的免疫反应。同时具有这两种通路突变的果蝇无法表达AMPs，因此容易受到感染[1]，[2]，[3]，[4]。黑腹果蝇拥有七个已充分描述的AMP家族，包括21个AMP和AMP样基因[5]。Drosomycin（Drs）由Toll通路调节[6]，Drosocin (Dro)、Defensin (Def)、Attacin (Atta)和Diptericin (Dpt)由IMD通路调节，而Cecropin (Cec)和Metchnikowin (Mtk)则由Toll和IMD通路共同调节[1]，[5]，[8]。NF-κB家族的三个主要转录因子调节AMP的表达：Dorsal、Dif和Relish[9]。Dorsal和Dif介导Toll通路的活性，而Relish介导IMD通路[8]。在昆虫中，Toll和IMD通路可以相互激活[10]，[11]，[12]，[13]。例如，最近的研究表明黄色微球菌在黑腹果蝇的Schneider 2（S2）细胞中更显著地参与了IMD/Relish通路的交叉激活，而枯草芽孢杆菌和异小杆线虫的激活作用则较弱[14]。
目前，有几种新的候选因子被发现参与了AMP基因的激活，因此研究它们与NF-κB的相互作用机制至关重要。其中一个候选因子是Deformed Epidermal Autoregulatory Factor 1（DEAF1），研究表明它可以在黑腹果蝇中调节免疫反应[15]，[16]。DEAF1是一种576个氨基酸的DNA结合蛋白，对胚胎发生至关重要，它可以识别hox基因Deformed启动子中的TTCG重复序列。DEAF1的突变会导致黑腹果蝇发育严重缺陷[16]，[17]。在黑腹果蝇 S2细胞中，DEAF1的敲低导致在黑腹果蝇 C病毒（DCV）感染背景下分析的九个AMP基因中有七个的表达显著下降。AttB、edin、Drs、DptB、AttA、Dro和CecC的表达下降，而CecA1和CecB未受到DEAF1敲低的影响[18]。此外，研究表明DEAF1通过TTCGGBT基序与Mtk和Drs的调控区域结合，从而在大肠杆菌和黄色微球菌混合感染后6小时激活它们的表达。此外，将这一基序插入原本缺乏它的Dpt增强子中，使DEAF1对该增强子产生了响应性。DEAF1与Relish、Dif和Dorsal的共同表达导致转录报告基因的协同激活[16]。鉴于DEAF1对Drs的调节是必需的，但对Dpt的调节不是必需的，因此有人提出DEAF1特异性地在Toll通路中发挥作用[16]。Kuttenkeuler等人进一步证明了DEAF1在Drs和Mtk转录中的调控作用[19]。
除了经典的DNA结合转录因子外，转录共调节因子也因其在将多蛋白复合体招募到活性基因的调控区域中的作用而受到广泛关注。值得注意的是，早期研究表明Akirin是NF-kB的共因子，对于激活某些依赖于Relish的基因是必需的，这一过程与H3K4ac表观遗传标记的存在有关[20]。此外，Akirin通过促进含有Osa的SWI/SNF样Brahma复合体（BAP）的招募来调节NF-kB的转录选择性[20]。最近的研究表明BAP复合体和Polybromo-associated BAP（PBAP）在免疫反应的调节中起着重要作用[21]。PBAP复合体的一个关键亚基是转录共激活因子SAYP（在哺乳动物中为PHF10/BAF45a），我们之前已经证明了它在基因表达调控中的多种作用。特别是，SAYP在黑腹果蝇的蜕皮激素信号级联和Jak/Stat通路中起着关键作用[22]，[23]，[24]，[25]。尽管有这些发现，它参与先天免疫反应的机制仍有待阐明。
在这里，我们首次全面分析了SAYP对黑腹果蝇免疫防御的贡献。质谱分析（LC-MS）确定DEAF1是SAYP相关蛋白复合体的一个组成部分。共免疫沉淀（co-IP）分析显示SAYP和DEAF1之间存在物理相互作用。通过RNA干扰介导的SAYP和DEAF1敲低实验揭示了它们在特定AMP基因转录调控中的关键作用。携带低表达SAYP突变的果蝇中也观察到了AMP基因表达的类似下降。此外，我们显示SAYP在AMP基因的特定调控区域与Relish和DEAF1合作。生存测试证明了SAYP在昆虫对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染中的重要性。与这些结果一致，大肠杆菌的刺激无法在这种突变品系中有效诱导特定的AMP基因。
伦理声明
抗体的生产过程中，动物的处理严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验室动物护理和使用指南》中规定的程序。所使用的方案得到了俄罗斯科学院基因生物学研究所生物伦理委员会的批准。所有操作都在有执照的兽医监督下进行，尽量减少动物的痛苦和不适。
S2细胞培养
S2细胞在添加了某些成分的Schneider's
黑腹果蝇培养基（Sigma）中培养
SAYP和DEAF1之间存在物理相互作用
之前，我们使用多步骤色谱法寻找与SAYP相关的蛋白质[22]，这使我们能够识别出与SAYP结合最紧密的伙伴。在本研究中，我们扩展了分析范围，寻找那些结合可能不太稳定的SAYP伙伴。为此，我们使用针对SAYP的抗体进行了单步免疫沉淀纯化；共沉淀的蛋白质通过质谱法进行鉴定。
讨论
在本研究中，我们证明了转录共激活因子SAYP在介导黑腹果蝇免疫防御中的关键作用。共激活复合体在基因表达调控中起着核心作用，尤其是在多种信号通路激活过程中。其中，多亚基SWI/SNF（switching defective/sucrose non-fermenting）染色质重塑复合体在黑腹果蝇中被称为Brahma。在黑腹果蝇中，Brahma复合体形成
CRediT作者贡献声明
Mona Ghassah：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学研究，实验设计，数据分析。
Yulia Ulianova：撰写——审阅与编辑。
Konstantin I. Balagurov：数据分析，撰写——审阅与编辑。
Anton A. Musabirov：数据分析。
Lyubov Lebedeva：资金获取。
Yulii Shidlovskii：撰写——审阅与编辑，监督，概念构思。
Zaur Kachaev：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，监督，方法学研究，
资金来源
本研究得到了俄罗斯科学基金会的财政支持[23–14-00348]。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
基因表达分析使用了俄罗斯科学院基因生物学研究所（IGB RAS）的核心设施，该研究所得到了俄罗斯联邦科学与高等教育部的大力支持。
我们感谢Bruno Lemaitre博士（瑞士洛桑联邦理工学院生命科学学院全球健康研究所）在黄色微球菌研究工作中的宝贵建议，以及他在方法方面的专业指导。
